脑脊液 | 生物标志物分类

参考资料：2018 Handbook of Clinical Neurology. The use of cerebrospinal fluid in biomarker studies.

脑脊液(CSF)中的多种成分，可用于多种目的的生物标志物研究，用于神经系统疾病通路中重要导联的诊断、预后、监测和识别。目前已广泛用于multiple sclerosis diagnosis和AD (tau蛋白的表达水平和磷酸化水平)的诊断。

由于需要通过腰椎穿刺获取脑脊液，属于侵入性取样，因此与其他样本（如血液）相比，脑脊液样本显得格外珍贵。

01 生物标志物种类

蛋白

蛋白标志物主要有以下3种。

• 某种蛋白仅在病理状态下出现，这种情况由特定的突变造成。如异柠檬酸脱氢酶1/2 (IDH 1/2)是胶质瘤的biomarker.

• 某种蛋白在病理状况下，表达量或修饰水平发生变化。如tau蛋白的表达水平和磷酸化水平升高，可作为AD的标志物。

• 某种蛋白可能是多种疾病状况的标志物。

蛋白标志物的常用分析方法：ELISA（针对特定已知蛋白）和蛋白组学（蛋白质谱技术）。CSF中的蛋白浓度比血浆中低大概200倍，因此需要高敏感度的方法来检测。

• ELISA：酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay（简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。
• 蛋白质谱技术：简单来说就是一种将质谱仪用于研究蛋白质的技术。目前，它的基本原理是蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子，质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（即质荷比，M/Z）的肽段离子分离开来，经过检测器收集分离的离子，确定每个离子的M/Z值。经过质量分析器可分析出每个肽段的M/Z，得到蛋白质所有肽段的M/Z图谱，即蛋白质的一级质谱峰图。离子选择装置自动选取强度较大肽段离子进行二级质谱分析，输出选取肽段的二级质谱峰图，通过和理论上蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行比对而鉴定蛋白质。

代谢物/分子 Metabolite

代谢物是细胞代谢的终产物或中间产物，参与能量转换、信号传导、表观修饰等过程。CSF中最常用的代谢标志物是葡萄糖含量，其可作为感染、炎症、恶化等过程的标志物。

代谢组学方法：质谱分析法可分析了许多生物样品中不同的代谢物；核磁共振波谱法。

cell-free DNA (cfDNA)

正常细胞在凋亡后会释放cfDNA,外周血中的cfDNA一般在150-200bp。CSF中的cfDNA主要用于检测恶性肿瘤的体细胞突变或病原体感染。肿瘤细胞释放的cfDNA的长度变化范围更广、可直接用于检测体细胞突变；CNS感染病原体后，来源于病原体的cfDNA可用于鉴定病原体。

检测方法：PCR（针对点突变）或全基因组测序

mRNA / microRNA

miRNA更加稳定，是内源性的非编码RNA，参与mRNA调控并介导多种细胞过程，通常长22-24核酸，并有发卡结构。
miRNA的异常表达模式已在多种神经退行性疾病中被报道，如multiple sclerosis, AD, trauma, CNS tumors.

检测方法：RT-PCR / qRT-PCR (针对特定miRNA); 二代测序（针对新的miRNA）

外泌体 Exosomes

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在30–100 nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。

多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。其中包含DNA、多种类型的RNA、脂质、蛋白和代谢分子等。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。

胞外囊泡（1-2um)和外泌体(30-100nm)已被视为神经退行性疾病和恶性肿瘤生物标志物研究的热点。

方法：超速离心获取外泌体，，然后提取其中的mRNA或DNA。

02 分析前的注意事项

作者大篇幅介绍了CSF成分的不稳定性，指出有多种因素会影响到分析结果。将其分为两类：患者相关的因素和环境（实验处理）因素。

患者相关因素

• 年龄、性别：衰老影响血脑屏障，从而影响CSF循环；年龄也与蛋白水平相关（如甲状腺素运载蛋白、凝胶溶素等）。
• 遗传背景：如ApoE4携带者的CSF中淀粉样β蛋白水平较低，NMDAR coagonists会影响CSF中NMDAR相关蛋白水平。
• 昼夜节律Circadian rhythm： Aβ42水平受昼夜节律影响明显；5-羟吲哚乙酸受季节性节律影响。
• 咖啡、巧克力、抽烟、饮酒

实验过程因素

• 腰椎穿刺
• 采集管：管的材质
• 蒸发：一般保存在-80或-20度，4.5年都没有蒸发。
• 离心速度和温度
• 质控：不同方法采集的样本，需要进行统一质控。

03 各类对照组的要求

不同对照组的纳入标准不同，由临床标准和实验室标准组成 （Table 1.4)。
QAlb：血浆和脑脊液之间的蛋白浓度梯度是由血-脑脊液屏障功能引起的，脑脊液球蛋白和与白蛋白的比例变化称作蛋白商。

对照组定义

04 如何发现新的生物标志物？

现在常通过组学（蛋白组学等）方法比较疾病早期的CSF和晚期的组织，来鉴定新的标志物。如常用的蛋白质谱法，但是目前能用于临床的标志物仍然很少，这主要归因于两点：一是目前的蛋白质谱的敏感度有限；二是CSF中蛋白含量很低。

另一个方法是利用多重抗体或aptamer-based芯片来提高抗体敏感性。这种芯片可以检测超过1000种蛋白。或者针对组织进行组学测定，找到差异表达蛋白，然后在CSF中检测这些蛋白；或根据溶解度和分泌亚型对CSF是否存在某些蛋白先进行预判。