Systems analysis of the mammalian target of rapamycin (mTOR) network under stress by multi-dimensional proteomics and computational modelling

【computational dynamic models】

6. Dalle Pezze, P., et al. A systems study reveals concurrent activation of AMPK and mTOR by amino acids. Nature Communications 7, 13254 (2016).

7. Sonntag, A.G., Dalle Pezze, P., Shanley, D.P. & Thedieck, K. A modelling-experimental approach reveals insulin receptor substrate (IRS)-dependent regulation of adenosine monosphosphate-dependent kinase (AMPK) by insulin. FEBS J 279, 3314-3328 (2012).
   8 Dalle Pezze, P., et al. A Dynamic Network Model of mTOR Signaling Reveals TSC-Independent mTORC2 Regulation. Science signaling 5, ra25 (2012).

8. Wolters, J.C., et al. Translational Targeted Proteomics Profiling of Mitochondrial Energy Metabolic Pathways in Mouse and Human Samples. J Proteome Res (2016).

cellular stress

The Thedieck lab has shown previously that mTOR activity under stress is tightly regulated by protein-RNA granules, so-called stress granules (SGs), which promote cellular survival. SGs are built in response to a multitude of stresses that inhibit overall translation, including heavy metals, oxidative, endoplasmic reticulum (ER) and genotoxic stresses. In addition to mTORC1 itself, also several other components of the mTOR network respond to stresses, but the exact molecular mechanisms and stress-specific regulation of mTORC1 substrates and translational targets are mostly unknown.

To gain a comprehensive overview of the stress response of the mTOR network, we
will study here initially arsenite as a surrogate stressor which induces oxidative, ER and genotoxic stress基因毒性压力, and heavily enhances SG formation and mTOR signaling4

【目标】
采用蛋白质组学和计算模型的方法来确定under cellular stress下的：
(i) novel mTOR regulators,
(ii) the mTOR interactome,
(iii) mTOR phosphoproteome,
(iv) translational targets of mTOR .
【最终结果】
(i) the hierarchy层次结构 of known stress responsive components,
(ii) lead to the discovery of novel mediators 中介of mTOR’s stress responses.

As many known elements of the mTOR stress response are dysregulated in cancer and this correlates with cancer survival and distant metastasis, our proposed study will likely reveal predictive markers for the drug response to mTOR inhibitors, and lead to the discovery of novel drug targets.
【研究计划、实施方法及所需时间】
该研究将利用多维度蛋白质组学技术鉴定细胞应激条件下新的mTOR调节器、mTOR相互作用组、mTOR磷酸化蛋白质组和mTOR的翻译靶标。细分为以下7步：
（1）细胞应激下mTOR网络的计算模型的建立和参数化（第1年）
先用亚硝酸盐刺激不同的乳腺癌细胞株(MCF-7, T47D和MDA-MB-231)至少90分钟以诱导细胞产生应激反应4678。再通过免疫印迹法获得mTOR网络中磷酸化组分的半定量时间序列数据。然后通过计算机模拟和实验验证的扰动实验建立基于常微分方程的mTOR网络的计算模型并进行参数化。
（2）发展靶向蛋白质组学工作流以优化mTOR网络的计算模型的参数（第1-2年）
在进行计划（1）的同时，根据靶向蛋白质组学分析得到的绝对定量数据再次建立基于常微分方程的mTOR网络的计算模型10。通过将该模型与计划（1）中的计算模型相比较以优化计算模型的参数并提高模型预测的精确性。
（3）使用鸟枪法蛋白质组学研究有或无mTOR抑制剂时磷酸化蛋白的动力学差异（第2年）
实验组添加mTOR抑制剂AZD8055，对照组不添加。两组均采用亚硝酸盐诱导细胞产生应激反应3。再将细胞裂解的产物进行酶解、液相分离和磷酸化富集，之后送 Q-Exactive 串联质谱分析。同时采用SILAC (stable isotope labelling in cell culture)标记的有标定量方法和无标定量方法进行定量。定量分析软件采用MaxQuant和我们课题组开发的SILVER（Bioinformatics 30, 586-587 (2014)）并比较其定量差异。

3. Schwarz, J.J., et al. Functional proteomics identifies acinus L as a direct insulin- and amino acid-dependent mTORC1 substrate. Mol Cell Proteomics (2015).

（4）通过定量蛋白质组学的方法分析应激诱导下mTOR相互作用组(第2-3年)
在计划（1）中应激诱导的同时，采用SILAC标记的定量蛋白质组学方法分析mTOR相互作用组。通过免疫沉淀反应富集内源性mTOR复合物并送串联质谱分析。我在炎症小体的研究中积累的蛋白质相互作用分析的经验（如采用SAINT对相互作用蛋白进行打分以表征其可信度）将应用于此。该分析将确定mTOR调节剂和底物的动态结合和释放，结合计划（3）中磷酸化蛋白质组数据，我们将确定其直接底物。3

（5）通过脉冲SILAC标记识别应激诱导下的mTOR依赖性翻译 (选做、第3年)。
为识别应激条件下哪些蛋白质以mTOR依赖的方式翻译，我们将通过脉冲SILAC标记技术测量从头蛋白合成。为此在计划（1）中加入亚硝酸盐的同时也将添加稳定同位素标记的氨基酸，并在各个时间点监测这些氨基酸向蛋白质的掺入。由于翻译过程较直接磷酸化过程有延迟，且脉冲SILAC分析耗时较长，若时间不充裕，可与他人合作。4.15
（6）聚类和建模分析在mTOR磷酸化蛋白组、相互作用组和翻译组间的动态属性(第3-4年)。
采用生物信息学方法对前5部计划中的磷酸化蛋白组、相互作用组和翻译组的数据进行整合分析。为此，我将采用聚类算法（如K-means聚类）将相似特征的蛋白质分组，再采用机器学习技术寻找这些蛋白质分组不同的动态属性。若某一蛋白质分组的动态属性与计划（1）中mTOR网络的计算模型所模拟的磷酸化属性类似，则该分组内的蛋白质极可能与mTOR网络功能相关。最终，我们将发现应激反应下与mTOR网络功能相关的一组新蛋白。进而发现新型mTOR调节剂和靶标。
（7）测试新型mTOR调节剂和靶标对不同应激的反应及其对癌症相关表型的影响（选做、第4年）。
采用多种应激反应条件（如ER、氧化、遗传毒性胁迫）来测试计划（6）中新鉴定到的mTOR调节剂和靶标针对不同的应激反应条件的特异性。并研究它们对癌症相关表型的作用，如细胞迁移、集落形成和存活。若时间不充裕，可与肿瘤系合作。