16s扩增子分析注意事项和经验总结Tips

个人1年多16s/ITS扩增子分析中积累的点点滴滴，此文适合新人了解相关零散知识，也适合有分析经验的人交流与讨论。

以下分析的经验，是以测序数据类型为Illumina HiSeq 2500产出的双端250数据类型(PE250)为基础。

1. 扩增测序技术选择：推荐使用PE250，性价比超高；
2. 原始数据使用fastqc质量评估，会发现数据右端末端质量较差，这是测序仪原理导致，我们在双端合并时还会利用另一端高质量序列进行校正，此处不必过分担心；
   
3. 双端序列合并方法qiime中有fastq-join和seqprep可选，不必太纠结，原理非常简单事，亲测两者差别不大，用默认fastq-join较快；
4. extract_barcodes.py提取barcode的种类很多，记得只有左端用barcode_single_end，其它全用barcode_paired_stitched，接头长度如实填写即可。
5. split_libraries_fastq.py中过滤质量-q选20，即准确度99%； –max_barcode_errors选项是否允许barcode错配不用纠结，一般的barcode调也不支持。
6. cutadapt去除引物需要-g/-a分两次去除，一次同时去会有很多无法去掉；
7. 聚类OTU前先使用usearch -derep_fulllength先去冗余，不然QIIME慢到想哭；
8. 聚类OTU推荐usearch -cluster_otus，直接高效的去除了嵌合体；
9. 依据参考数据库去除嵌合体，推荐使用usearch -uchime_ref和RDP_gold数据库
10. align_seqs.py和filter_fasta.py配合去除非细菌序列；
11. biom的convert, add-metadata要学用，不仅需要格式转换，还需加添加注释信息；
12. assign_taxonomy.py的方法有uclust, blast, rdp等，我比较感觉rdp方法注释的最全面；
13. 多序列比对使用clustalo方便多线程快速比对；
14. make_phylogeny.py默认使用fasttree建树极快；
15. alpha_diversity.py计算前需要使用single_rarefaction.py进行重抽样，推荐数据量1万-3万；
16. alpha_diversity.py常用的多样性种类，包括shannon,chao1,observed_otus,PD_whole_tree，最后一种还需要树方件；
17. normalize_table.py将OTU-table进行CSS方法标准化，再进行beta多样性分析结果更好；
18. beta_diversity.py常用方法有bray_curtis,weighted_unifrac,unweighted_unifrac，根据结果再选方法；