蛋白质组学技术与药物作用新靶点研究进展

[关键词]：蛋白质组学,新药发现,药物作用靶点,研究进展

    药物开发是一个漫长的过程，包括以下步骤：样品制备、新化学实体的发现、靶的探测与验证、先导物选择、小分子筛选和优化以及临床前、临床试验研究等。其中药物作用靶点的探测与验证是新药发现阶段中的重点和难点，成为制约新药开发速度的瓶颈。基因组学研究表明，人体中全部药靶蛋白为1万～2万种，而在过去100年中发现的靶点，仅约有 500种。因此，自1994年Wilkins等提出蛋白质组（pro- teome）和蛋白质组学（proteormcs）概念后，就迅速引起广大研究者和制药公司的兴趣和投资。近几年来，蛋白质组学技术和研究思路都有了令人鼓舞的进展，新技术的出现和发展，如多维色质联用（multidimensional liquid chromatography and tan- dem mass spectrometry, MudLC-MS/MS）、表面增强激光解吸离子化-蛋白质芯片系统（surface enhanced laser desorption ion- ization-proteinchip, SELDI-ProteinChip）、同位素亲和标签（iso- tope-coded affinity tags, ICAT)、胶上差示电泳(differential in- gel electrophoresis, DIGE）等技术，弥补了普通双向电泳上样量和检测极限的局限，自动化、特异性和重复性都得到了加强。

    蛋白质组学是研究疾病发生过程中蛋白质变化、生化代谢途径改变和鉴定的有力工具。在药物开发中的作用主要表现在疾病检测、药物靶点发现、药物代谢转化、药物不良反应研究等方面。通过比较正常体与病变体、给药前后蛋白质谱的变化，蛋白质组学技术可提供疾病发生、药物作用和药物不良反应的分子机制信息。通过蛋白质组学鉴定的特异生物标记可作为排查药物的功效、抗性和优选。因此，蛋白质组学在药物研究开发中的各个方面得到了细化，如化学蛋白质组学(chemical proteomics），拓扑蛋白质组学（topological proteomics），临床蛋白质组学（clinical proteomics），毒性蛋白质组学（toxicoproteomics）和药物蛋白质组学（phamiaco- proteormcs），这些“亚蛋白质组学”技术的发展，与基因组学结合，将对药物靶标验正和药物开发引起重大变革。笔者就蛋白质组学及相关技术在药物作用靶点的探测和验证方面的应用作一概述。

    1　药靶的探测

    与药物作用相关的靶或蛋白质主要有3类：①疾病相关（特异性）蛋白质；②生物标记分子；③信号传导分子。蛋白质组学探测药物作用相关靶点的基本策略是蛋白质组的比较，即健康与病变组织、细胞或体液（如血清、脊髓液、尿液和气管呼出物等）的蛋白质表达谱差异和表达量变化。蛋白质组学已成功用于肿瘤、糖尿病、艾滋病、关节炎等多种疾病相关蛋白或标记蛋白的检测，成为疾病诊断、监测、治疗的有力工具。例如丹麦人类基因组研究中心Julio Celis实验室从膀胱鳞片状细胞癌(SCC)患者的尿液中分离鉴定了一个生物标记—牛皮癣素(psoriasin)，免疫组织化学分析表明该蛋白质在正常人的泌尿系统中不存在，因而成为临床检测膀胱鳞片状细胞癌的标记蛋白。

    给药前后蛋白质组比较，是比较蛋白质组学的另一个重要内容，是探测新靶蛋白，深入了解药物作用机制，评价药物不良反应，更合理地设计药物的一个新途径。Chen等利用这个方法，找到了抗MCF-7人乳腺癌药物阿霉素的一个作用靶—Hsp27。

    类似的方法也用于探测信号传导途径中的药物作用靶。信号级联放大系统中信号的传递一般与蛋白质磷酸化／去磷酸化密切相关。通过合适的预分离技术，如亚细胞蛋白质组制备或用免疫色谱分离磷酸化的亚蛋白质组，得到与信号传导途径相关的蛋白质组以及在细胞中的定位信息，然后通过双向电泳技术分析蛋白质修饰和表达变化。利用这个方法， Stancato等在人原淋巴细胞中（经IFN-α或IL2处理）找到了与 IFN作用相关的信号传导靶点。

    化学蛋白质组学是药靶检测的另一重要方法。化学蛋白质组是全蛋白质组的一个亚类，指的是经化学标记浓缩的那部分特殊蛋白质。疟原虫入侵血红细胞的阻断靶点探测就是化学蛋白质组学成功应用的一个例子：半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫（plasmodium falciparum）生存必需的酶，Green- baum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针（1251- DCG-04）打靶，然后通过抗DCG04的生物素纯化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组，通过酶活性分析，最终发现在疟原虫的入侵血红细胞的裂殖期，仅有一个有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质—falcipain 1。从化学数据库筛选到falcipain I的抑制剂YA29-Eps,结果证实YA29-Eps可阻断疟原虫的入侵血红细胞。

    最近，一种被称为生色团辅助激光灭活（chromophore-as- sisted laser inactivation，CALI）的化学蛋白质组学方法也被用于蛋白质靶的检测与验证过程。CALL能够直接对蛋白质进行操作，而不是通过对蛋白质量的变化进行检测。将标记有孔雀绿染料的非功能灭活抗体与特异性蛋白质结合，然后对蛋白质复合物进行激光照射。染料受激光激发短暂的产生活性分子，对结合的蛋白质造成破坏而起到灭活作用，但不影响其他蛋白质组分。所采用的激光波长为620nm,该波长不容易为细胞吸收，因而激光不会对细胞产生破坏作用。所以CALI是一种能够对活细胞蛋白质精确灭活的新技术，是药物作用靶点探测和验证的有力工具。目前CALI已经在肿瘤的不同信号传导途径靶的检测中得到应用。例如Jay 等利用CALL技术对ezrin和pp60-c-src蛋白质功能分析，表明这两个蛋白质参与了肿瘤发生过程。

    此外，由于传染病仍是引起死亡的主要病症之一，抗感染药物的开发仍是各国研究的热点。蛋白质组学技术可以让人们清楚地了解病原菌蛋白质在抗生素作用下发生改变的情况，并以此进行新型抗生素药物开发。微生物基因组序列测定的完成为基因组蛋白质的鉴定提供了基准。利用蛋白质组学技术，Mcatee等研究了幽门螺杆菌（HP）对甲硝唑（NM）的耐药性。对因rdxA基因突变引起中度耐NM的 HP2b695株增殖、裂解后进行蛋白质组表达蛋白差异分析，发现有几种蛋白质比正常细菌增加了一倍，并发现AHP（一种存在于各种原核和真核系统中的氧中毒耐受相关的必需酶）的各种亚型的表达水平增加，从而认为HP的Mu耐受表型株的AHP水平升高有较大意义，对HP的治疗有很大的帮助。因此，除了对动物（包括人）的蛋白质组学研究外，细菌的蛋白质组学也逐渐成为新药研究的一个重要内容，包括病原菌与宿主蛋白质相互作用研究。

    蛋白质组学还可以用于药物不良反应作用靶点的探测，包括药物毒性检测和药物候选时毒性预测。用已知的毒素处理机体组织，比较处理或未处理组织的蛋白质谱变化，可显示出药物的毒性。环孢菌素A(cyclosporine A, CsA)成功用于器官移植手术和自身免疫疾病的治疗中，但同时具有严重的肾毒性。Aicher等研究了环孢菌素A对小鼠肾组织的毒性。比较CsA处理/不处理的小鼠肾组织蛋白质2DE图谱，找到了一个经CsA药物作用后表达下调的一个蛋白质 calbindin。该蛋白质在肾小管中发现，能与Ca²⁺结合，起转运功能。病理组织学研究表明calbindin的下降与肾小管内钙化有关。

    2 靶点的验证

    仅仅检测出与疾病相关的蛋白质（靶）还不足以开始药物的筛选，验证这些蛋白的功能、确定蛋白质在疾病发生过程中所起的作用，对于继续药物发现的过程非常关键。因此靶的验证也是药物发现中的瓶颈之一。研究蛋白质功能、相互作用是靶点验证的主要方法。

    酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是分析蛋白质相互作用强有力的方法之一，不但可以用来在体内检验蛋白质的相互作用，而且还能用来发现基因文库中相互作用的新蛋白质，研究某一特殊蛋白质复合体和蛋白质相互作用网络。其原理是将转录激活因子的DNA结构域（DB)和转录激活结构域（AD）与待检测的一对蛋白质融合（分别称作“诱饵” 和“猎物”），检查报告基因（reporter gene）的表达。因为转录激活因子结构上是组件式的，如果待检测的蛋白质存在相互作用，DB和AD可以形成复合体，报告基因就表达。Vidal 等在酵母双杂交系统基础上发展一种“逆双杂交系统（re- -two-hybrid system）。这项技术的关键是引入了URA 3基因。该基因编码的酶能将5-氟乳清酸（5-FOA）转化为对细胞有毒的物质，蛋白质之间存在相互作用时，URA3基因表达，细胞生长受到抑制，起到了反选择作用。这种逆双杂交系统主要用于鉴定可以干扰蛋白质间相互作用的化合物和多肽。

    膜蛋白是一类重要的药物作用靶和受体。因为膜蛋白不能在核内融合构建，所以经典的酵母双杂交系统不能用来分析膜蛋白的相互作用。Stagljar等发展了一种胞质双杂交系统（cytoplasmic two-hybrid system），也称作断裂-泛素双杂交系统（split-ubiquitin two-hybrid system），可用来研究膜蛋白间的相互作用。泛素是一种在真核细胞中普遍存在的由76个氨基酸组成的蛋白质，结构保守。泛素结合在蛋白质的N 端，可作为泛素特异蛋白酶（ubiquitin-specific protease, UBP)剪切蛋白质的标记。研究发现，如果将泛素C端（Cub，第35－ 76位氨基酸）与一个报告蛋白（通常是转录激活因子）构成融合蛋白，让它与N端部分（NubI，第1～34位氨基酸）一起在酵母细胞中共表达，结果发现NubⅠ与Cub能够重新形成有功能的泛素（断裂-泛素），并由UBP识别并切断Cub-报告蛋白之间的共价键，结果报告蛋白从泛素中释放出来。该系统巧妙地解决了膜蛋白之间的相互作用与核报告基因激活两者在空间上的矛盾。实践中构建NubⅠ融合蛋白时使用了 NubⅠ的一个点突变形式NubG，避免了NubⅠ与酵母自身的 Cub结合产生假阳性。利用该系统，以proteinA-LexA-VP16为报告蛋白,Stagljar证明内质网膜上的寡糖基转移酶的两个亚基Wbplp与Ostlp之间存在相互作用，而膜上的另一个蛋白 AIg5则与Wbplp不存在相互作用。

    蛋白质芯片的原理是将各种纯化的蛋白质有序地排列于滤膜或玻片上，然后用荧光标记的蛋白质或小分子、药物为探针与蛋白质芯片保温，漂洗去除未结合探针，进行荧光分析。蛋白质芯片是一种类似于基因芯片的高通量筛选方法，在药物开发中的作用主要有以下几方面：①为药靶筛选先导化合物；②检测与小分子结合的物质（如药物、先导化合物）；③研究小分子结构与蛋白质结构结合方式等。 Kukam等在蛋白质芯片基础上，发展了红色（RFP）和绿色 (GFP）荧光标记蛋白，可实现蛋白质多样品的并行研究和快速高通量功能检测。

    生物传感芯片（biosensor chip）是一种新的芯片蛋白质组学方法，可用来鉴定蛋白质复合物、蛋白相互作用的位点、监测蛋白质复合体形成和解离的动态变化、筛选孤儿受体的配体。该技术是基于蛋白质芯片，结合两种仪器分析新技术的基础上发展起来的：表面离子化共振-生物分子相互作用分析传感（surface plasmon resonance-biomolecular interaction analy- sis，SPR-BIA）或共振镜传感（resonant mirror，RM-BIA）和基质辅助激光解吸飞行时间质谱技术（matrix-assisted laser-desorp- tion ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF- MS)。SPR和RM分别使用玻璃棱镜和波导器传感。 SPR的工作原理是：当一束平面单色偏振光以一定角度人射到镀有薄层金膜的玻璃棱镜表面，入射光的波向量与金膜表面电子振荡频率匹配，引发表面电子共振。入射光以一定角度照射棱镜表面，可使反射光强度达到最小，此人射光角度称作SPR角。如果金膜表面结合有其他分子，可引起人射光折射率的改变，这种改变与结合的分子质量成正比关系。 SPR-BIA基于这一原理，将探针或配体固定于传感器芯片金镀膜的表面，含分析物的液体流经传感器表面，分子间的特异性结合引起折射率的改变，通过检测SPR信号监测分子相互作用。并可获知相互作用的特异性、浓度关系、动力学过程、亲和性大小，以及是否存在异构效应等。应用MALDI- TDF-MS鉴定传感器表面的分析物，实现了分子相互作用的定性和定量的结合。Werawatgoompa等采用SPR技术对人体内铁蛋白含量进行实时监测，他们将兔抗人铁蛋白抗血清固定于传感器上，通过监测SPR信号检测铁蛋白与抗体的特异性结合。利用该方法可监测血液中浓度范围为25～800 ng. mL _‘的铁蛋白，为临床疾病的诊治提供依据。生物传感芯片已经成为功能蛋白质组学研究的重要方法。

    转染细胞微阵列（transfected cell microarray, TCM）是蛋白质芯片的一个补充技术。该阵列（芯片）的特征是由含有过量表达已知cDNA的细胞簇组成。即纳升级的含cDNA的质粒溶于水质的凝胶溶液，然后点于玻片上。含质粒的芯片置于脂质试剂中，形成脂质体DNA复合体，玻片放于培养皿内，然后加入哺乳动物细胞和黏附剂后，质粒可转染到与之接触的细胞中，细胞因而获得了外源DNA而具有新性状。细胞固定化后，可通过原位杂交、免疫荧光或放射自显影显色。转染细胞微阵列可通过功能特征筛选细胞芯片基因表达产物中潜在的靶点，评价药物先导物的特异性，以及鉴定蛋白质作为未知作用机制的药物或基于表型芯片的先导物。Ziauddin等检测了转染细胞微阵列表达的192种不同的cDNA，鉴定了包括酪氨酸激酶信号途径、细胞凋亡和黏附相关的多种蛋白质，以及它们在细胞中的不同分布。

    另一种常用的蛋白质筛选和鉴定方法是抗体的使用。如用噬菌体抗体展示（phage antibody display system）建立一个抗体文库，抗体基因与噬菌体衣壳蛋白基因融合，表达后可分泌到噬菌体衣壳的表面（表面呈现，surface display）。然后用目标多肽或蛋白质探针从噬菌体文库种钓出特异的抗体用于筛选。该技术目标是基于抗体文库构建一个与目标配体相关的蛋白质表达信息数据库。

    3　靶点的优化

    一种理想的药物应能够特异有效地与干扰疾病的靶点结合，并且要求安全。对药物靶点的优化，即作为靶点的蛋白质是否为候筛药物的最佳选择，是否为治疗的最佳位点的研究，也是药物发现中非常重要的内容。靶点优化的过程，实际上是综合各种信息的最优算法。

    Swindells等报道了优化的蛋白质组学方法用于药物相关靶点的优化和鉴定。利用表达芯片（expression array）鉴定在不同细胞中差异表达的蛋白质转录物。并将实验技术与信息学结合起来，对蛋白质家族进行分类，利用已入药的（蛋白质家族）成员来定义结构域家族，通过BLAST配对将蛋白质归纳入各个划定的家族。应用3D结构数据优化药物相关蛋白与实验检测到的可能靶的模拟计算预测，并且根据疾病的单核苷酸多态性（SNPs），以及质谱数据解析疾病过程中蛋白质的功能和疾病发生途径，确定最佳的药物作用靶点。此外，将蛋白质组学技术体系与涉及小分子抑制剂、抗体、抗原的一些技术手段整合，将有助于更好地评价、考察靶点的有效性。

    药物受体相关蛋白质数据库也为药物开发过程提供参考。G蛋白偶联受体、离子通道、核受体、蛋白激酶、磷酸化酶、蛋白酶、磷酸二酯酶等是主要的治疗靶标。治疗靶标数据库（therapeutic target database,TTD）（http:// xin.cz3.nus.edu.sg/group/ttd.ttd.asp）包括了以上几种主要的靶标，数据库总共含有125种疾病的433种治疗靶，以及相对应的809种药物。药物的ADME(absorption，distribution, metabolism, excretion)相关蛋白质数据库，包括了药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程的331种蛋白质，是合理设计药物的重要参考依据。这些数据库资源，是药物作用靶点的检测、确定和优化过程的重要参考资料，对研究药物的治疗效果、不良反应、药物代谢过程ADME和人体反应有重要辅助作用。

    4 展望

    蛋白质组学是在基因组学、蛋白质分离分析、质谱技术等成熟和结合的基础上发展起来的一门新学科。它从全局角度研究某一特定蛋白质组的表达、相互作用和不同状态下的动态变化。短短几年内，蛋白质组学的技术和方法有了很大发展，并且不断与其他学科(组合化学，基因组学，生物信息学，药理学等）相整合，呈现出自动化、多维化、信息化的发展态势，一个不断成熟的蛋白质组学方法技术体系正在形成。有理由相信，蛋白质组学的应用将不断扩大，为人类揭开越来越多的生命活动奥秘和规律。从细胞和分子水平上探讨人类重大疾病的机制、诊断、防治和新药开发将提供重要的理论基础，为人类进步和发展作出贡献。 （中国药学杂志第40卷第8期）