Velvet基因组拼接方法和参数详解

1. Velvet的安装
   Velvet用于基因组的de novo组装，支持各种原始数据，包括Illumina的short reads和454的long reads。
   首先下载velvet的安装包，直接使用make命令来编译，即可获得可执行主程序velveth和velvetg。安装如下：

$ wget http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/velvet_1.2.10.tgz
$ tar zxf velvet_1.2.10.tgz
$ cd velvet_1.2.10
$ make ‘CATEGORIES=10’ ‘MAXKMERLENGTH=57’ ‘LONGSEQUENCES=1’ ‘OPENMP=1’ ‘BUNDLEDZLIB=1’
值得注意的是，make后有多种参数，需要对velvet软件进行需要的设置：

CATEGORIES=10： 默认情况下velvet只能输入 2 groups of short reads，此处设置为10. 如果有多个文库或多种类型的原始数据，需要相应增加该值的大小。该值越大，耗内存越大。

MAXKMERLENGTH=57： 最大的Kmer长度，默认情况下该值为 31， 一般de novo组装基因组，31 是不够的，故需要增大该值。组装过程中kmer越大，越耗内存。

BIGASSEMBLY=1： 当超过 2.2G 的reads用于组装基因组的时候，需要设置该值。实际上很少会有如此之多的reads用于基因组组装，可以不用设置该值。设置该值后，会消耗更多的内存。

LONGSEQUENCES=1： 当组装出的contigs长度超过 32kb 长的时候，需要设置该值。会消耗跟多内存。

OPENMP=1：打开多线程运行。需要设置环境变量 OMP_NUM_THREADS 和 OMP_THREAD_LIMIT。 Velvet最多使用 OMP_NUM_THREADS+1 或 OMP_THREAD_LIMIT 个线程。也值哟部分的velvet算法支持多线程运行，不会造成运行时间的线性减少。

BUNDLEDZLIB=1： 默认velvet使用系统自带的zlib，如果系统没有zlib，则需要加入该参数来使用velvet源码包中自带的zlib。

在上述 make 编译完 Velvet 后，继续velvet的使用

2. 使用velveth来准备数据
   velveth接受输入的文件，产生一个hash表。生成两个文件：Sequences和Roadmaps。velveth用法为：

$ velveth
$ velveth output_directory hash_length
-file_format -read_type filename1 filename2 …
[-file_format -read_type filename1 filename2 …]
在不带参数情况下，直接运行velveth会给出其帮助文件。而其参数如下：

output_directory：输出文件夹的路径

hash_length： 设置Kmer的大小。该值3点要求：1.必须为奇数；2.必须小于或等于编译velvet时设置的MAXKMERLENGTH值；3.必须小于reads的长度。

file_format： 支持的格式有fasta（默认）、fastq、bam等。

reads_type： short(默认)、shortpaired、short2、shortpaired2 … short10、shortpaired10、long、longPaired。 默认情况下short reads只保留了2个通道。在之前设置中将CATEGORIES值设置为10，则velvet最多支持10种不同类型的short reads数据。long支持长的reads，比如sanger测序数据和454测序数据。 如果reads_type一致，则同一个reads_type下可以有多个文件。

filename1： reads的文件名。如果是成对的reads，则需要将两个reads文件合并成一个文件。Velvet安装文件夹中提供了这样的一个文件。

一个velveth的例子。对5个Illumina测序的结果和一个454测序的结果使用velvet进行组装：

$ velveth output/ 31
-shortPaired -fastq fragment1.reads.fastq
-shortPaired2 -fastq fragment2.reads.fastq
-shortPaired3 -fastq jumping1.reads.fastq
-shortPaired4 -fastq jumping2.reads.fastq
-long -fastq 454.fasta
3. 使用velvetg来进行基因组组装
velvetg是vlevet软件的进行de Bruijin图构建和操作的核心。在命令行下直接键入命令velvetg，这样描述：velvetg – de Bruijn graph construction, error removal and repeat resolution。其使用方法如下：

$ velvetg
$ velvetg directory [options]

$ velvetg output -exp_cov auto -cov_cutoff auto
-shortMatePaired3 yes -shortMatePaired4 yes
-clean yes -scaffolding yes -amos_file yes
velvetg的具体参数如下：
directory 工作的目录名，即为上一步骤velveth中的输出文件夹。

-cov_cutoff default： no removal
设置最低kmer覆盖度的值。默认下会生成很多nodes，而有些nodes很短，覆盖度较低，需要去除掉。auto则自动设置该值，是该值为所有nodes的kmer覆盖度值的median值的1/2。

-exp_cov default： no long or paired-end read resolution。
期望的kmer覆盖度。如果设置了auto，则该值为所有nodes的kmer覆盖度值的median值; 该值设置为auto，则同时自动设置-cov_cutoff为auto。如果对杂合基因组进行组装时，设置auto，却很难进行预测，组装结果肯定不好。 auto适用于标准的基因组测序。

-long_cov_cutoff default： no removal
移除低long-read覆盖度的nodes。

-ins_length
成对的short reads间的distance的期望值，即插入片段的平均长度。

-ins_length*
代表第组shortPaired reads, 和 velveth 中的参数相对应。

-ins_length_long
和前两个参数一样，代表longPaired reads的插入片段长度。

-ins_length*_sd
此时’*'代表’nothing、2、3…、long’等，和上面的3个参数相匹配；该值设置插入片段长度的标准差。有关插入片段长度和sd的如果不设 置，velvet则会自动计算。velvet是将成对的reads比对到组装出来的nodes上，最后计算出一个insert size 和sd。这样做的话，可能估算的不准确，需要看velvet的运行输出信息，检测其预算是否准确。

-scaffolding defautl: yes
是否要使用paired end信息进行scaffolds组装

-max_branch_length default: 100
处理气泡(bubble)的参数。默认下，如果两条序列超过了100bp的位点处的kmer不一致，则将这两条序列分开成单独的contigs。

-max_divergence default: 0.2
在一个bubble内两条branches最大的差异率（分母为较长的branch的长度）。

-max_gap_count default: 3
在一个bubble内两条branches比对结果中，运行的最大gap数。该参数和上两个参数为重要的参数，能很大程度上影响组装结果。如果设置得松点，可分别将值设为200,0.33,5。

-min_pair_count default: 5
默认，将两个contigs连成scaffold最少需要5对paired reads的验证。如果测序深度较大，则可以提高该值；测序深度低，则降低该值。

-long_mult_cutoff default: 2
默认下，融合两个contigs需要最少有2个long reads验证。

-max_coverage default: no removal
最高的覆盖度，高于此覆盖度的nodes将被删除。

-coverage_mask default: 1
contigs最小的置信覆盖度，低于此覆盖度的contigs被maksed。

-shortMatePaired* default: no
如果哪一个shortPaired为mate-pair library测序的结果，则需要指定该参数为yes。

-conserveLong default: no
是否保留含有long reads的序列

-unused_reads default: no
是否输出unused reads, 保存到 UnusedReads.fa 中。

-alignments default: no
是否输出contig比对到参考序列的summary.

-exportFiltered default: no
是否输出由于覆盖度的原因被过滤掉的long nodes。

-clean default: no
是否删除所有的不能用于重新计算的中间文件

-very_clean default: no
是否删除所有的中间文件（删除后不能重新计算）

-min_contig_lgth default: hash length * 2
输出结果中最小的contigs长度

-amos_file default: no
是否输出AMOS文件

velvetg的默认输出结果
directory/contigs.fa 长度2倍长于kmer的contigs。参数-scaffolding决定生成的该fasta文件是否包含scaffold序列。
directory/stats.txt 用于决定覆盖度cutoff的统计表
directory/PreGraph 初始的de vruijin图
directory/Graph2 最终的de bruijin图 关于该文件中内容的解释，请见velvet PDF manual。
directory/velvet_asm.afg AMOS兼容的组装文件，能用于AMOS基因组组装软件包
directory/Log velvet的运行记录

4. Velvet提供了额外的一些scripts
   这些scripts非常有用，位于$velvetHome/contrib/文件夹下。

4.1 estimate-exp_cov
在使用velvetg组装出一个初步结果后，利用结果文件stats.txt来估算出kmer的期望覆盖度。

$velvetHome/contrib/estimate-exp_cov/velvet-estimate-exp_cov.pl
[options] stats.txt
4.2 observed-insert-length.pl
在使用velvetg组装出一个初步结果后，以结果文件夹为输入，计算insert size和insert sd。

$velvetHome/contrib/observed-insert-length.pl/observed-insert-length.pl
[options] Velvet_directory
4.3 shuffleSequences
将对称的reads1和reads2文件合并成一个文件，用于velvet的输入。velvet不能将两个文件用于输入。

KaTeX parse error: Undefined control sequence: \ at position 69: …ences_fastq.pl \̲ ̲ reads1.fastq …PATH中有velveth和velvetg两个主要 的velvet命令。以下就不详细介绍该命令参数，仅给出一个例子:

$velvetHome/contrib/VelvetOptimiser-2.2.4/VelvetOptimiser.pl
–s 17 --e 97 --x 2 --a --t 4 --k ‘n50’ --c ‘Lbp’
–f ‘-shortPaired -fastq fragment1.reads.fastq
-shortPaired2 -fastq fragment2.reads.fastq
-shortPaired3 -fastq jumping1.reads.fastq
-shortPaired4 -fastq jumping2.reads.fastq
-long -fastq 454.fasta’
-o ‘shortMatePaired3 yes shortMatePaired4 yes’
[-g 40M]
以上命令意义为：使用kmer长度从17到97，每次运行kmer长度+2； –a表示要生成amosfile；使用N50来决定kmer的选取；以’Lbp’,即大于1kb的contigs的总碱基数来决定coverage cutoff的值的选取；–f后为velveth的参数；–o后接velvetg的参数；-g后为预计的基因组大小，用于计算该命令下内存的消耗，然后退 出运行，由于该程序会同时运行多个velvet和velveg，消耗的内存巨大。

4.5 AssemblyAssembler
该程序能使用不同的kmer组装出很多Assemblies，然后将这些Assemblies组装融合出一个最终的结果。其使用方法位于该程序的通目录下的README文本文件中。给出一个例子如下：

$velvetHome/contrib/AssemblyAssembler1.3/AssemblyAssembler1.3.py
-s 17 -e 99 -v $velvetHome -c 5.1 -t 35 -i 300 -m 51 -r y
-f “-fastq -shortPaired reads.fastq”
以上命令意义为：使用从17到99的kmer，每种kmer都组装出基因组并最后合并成一个结果。-c为coverage cutoff值；-t设置为只有大于35的kmer时，才进行coverage cutoff；-i表示插入片段长度为300；-m表示期望的kmer覆盖度为51；-r表示结果给出short reads要包含到最后的组装结果中。

可以看出该程序适合于只有一种类型的short reads时，才适合。因为其参数-i只能设置一种插入片段长度大小。

4.6 其它程序
extractContigReads用于提取和指定conting相对应的reads；

afg_handing 用于检查 .afg 文件；

fasta2agp 用于将fasta格式的基因组组装结果(gaps用N表示)转换成AGP文件，用于提交到EMBL或NCBI；

show_repeats 指出Assembly中larger repeated contigs的长度；

read_prepare 和 select_paired 用于NGS数据的过滤