2020.09.15丨细菌&真菌基因组测序原理

• 细菌基因组测序原理
  • 细菌定义：
    • 属于原核生物，无核膜、DNA裸露，分真细菌和古细菌两大类的微生物。是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。
  • 细菌基因组特点：
    • 基因组：一般在0.16- 13Mb，大部分在5M左右；
    • 编码序列：占总长度的90%，基因平均大小为 1kb；
    • 结构特点：多为一条环状闭合双链DNA，无内含子
  • 细菌基因组产品类型、
    • 产品列表
      • Pacbio 准确率较高，成本高
      • ONT测序平台通量高，成本低（混样建库加Barcode：一个Cell混12---24个样儿）
  • 细菌泛基因组：
    • 细菌泛基因组：同种细菌不同菌株所有遗传信息的集合，包括核心基因和附属基因
    • 核心基因：细菌内大多数菌株都存在的共有基因，这些基因决定了所有个体的基本功能
    • 附属基因：细菌群体中，某些菌株特有的基因，决定了这些菌株特有的表型及功能
    • 研究流程
    • 研究思路
      • 同属不同种：
        • 遗传多样性高，不同菌种间形状或者功能差异较大，同一菌种不同株系多样性同样较高，寻找物种特有的功能基因。
      • 同菌种不同亚种：
        • 基因组变异快，同一菌种不同株系间基因序列或基因差异较大，如有毒株和无毒株，揭示毒性差异的原因。
      • 功能相同或相似：
        • 无亲缘关系，如古菌与细菌间，寻找水平基因转移。
  • 细菌基因组完成图产品思路（2+3）
    • 材料选择
      • 单菌落、无污染
    • 送样要求
      • v 菌体送样：
        • ① 显微镜下观察细菌生长状态，收集对数期的细菌。OD值=0.5~0.6
        • ② 将适量（5ml）体积的菌液转移至2mL旋盖尖底离心管中，于室温下14000xg离心1min。
        • ③ 弃尽培养基，将细菌沉淀迅速置于液氮中冷冻1h，转移至-80℃或液氮中长期保存。
        • ④ 干冰运输
      • v DNA样品：（Qubit）
      • v 细菌泛基因组/细菌框架图（浓度：≥50ng/uL，总量≥2ug）
      • v 细菌完成图Pacbio：（浓度：≥20ng/uL，总量≥15ug）
      • v 细菌完成图ONT：（浓度：≥60ng/uL，总量：1-2ug）
      • OD260/280=1.8~2.0，OD260/230=2.0~2.2，无单链DNA、RNA、蛋白等杂质污染
    • 建库测序
    • 数据分析
      • 技术路线图
      • 基因组组分分析
      • 功能基因注释
        • 通用数据库：GO, KEGG, COG, Swiss-prot, Nr, pfam
        • 专有数据库：CAZyme，ARDB，PHI，VFDB
      • 比较基因组：
        • 基因家族分类；特有和共有基因检测；快速进化基因检测；物种间进化关系分析；共线性分析
• 真菌基因组测序原理
  • 真菌基因组
    • 真菌基因组主要指各种真菌，包括各种酵母（约18M），霉菌，食用真菌等。一般在10M-150M，大部分是50M左右。复杂真菌有多核，杂合等现象
  • 真菌基因组产品类型
    • 产品类型图
      目前微生物事业部完成的Hi-C项目：白灵菇、木霉菌、酸腐菌、酵母、炭疽菌
  • 真菌基因组调研图
    • 基因组调研图信息分析流程
    • Kmer分布图
  • 真菌基因组精细图分析流程
    • 技术流程图
    • ONT真菌精细图承诺contig N50≥2M，实测数据contig N50＞9M
  • 真菌基因组送样要求
    • v菌体送样
      • ①大型真菌：从菌体上取生长旺盛的组织，无菌水冲洗干净，75%乙醇冲洗，吸水纸吸干样品表面；若组织体积大，应剪切成小块儿，保存于无菌2mL离心管中液氮冻存1h，-80℃保存，干冰运输。组织样品要求：>10g
      • ②微型真菌或酵母菌：显微镜下观察真菌生长状态，收集对数期的真菌。OD值=0.5~0.6，将适量（10--20ml）体积的菌液转移至2mL旋盖尖底离心管中，于室温下14000 g离心 1 min；弃尽培养基，将真菌沉淀迅速置于液氮中冷冻1h，转移至-80℃或液氮中国长期保存；干冰运输
    • v真菌HIC送样要求
      • 1、可以提供活体或者冻存菌体
      • 2、活体培养在液体培养基中，根据菌体的生长习性和运输距离，结合老师的经验选择冰袋或者常温运送，保证菌体存活
      • 3、冻存菌体为液氮速冻（将菌体转移至离心管中，然后将离心管放置于液氮中完成速冻），干冰运输
      • 4、大约0.5g菌体/1个文库，最好提供1g以上的菌体
      • 5、不需要老师提供培养基配方，不提供接种、转板等服务
      • 6、样品到后，如果没有及时下实验任务单，实验室对于冻存样本提供-80℃保存，对于活体样品提供4℃或常温保存。
    • DNA样品：（Qubit）
      • 真菌调研图：（浓度：≥30ng/uL，总量≥2ug）
      • 真菌精细图Pacbio：（浓度：≥20ng/uL，总量≥15ug）
      • 真菌精细图ONT：（浓度：≥60ng/uL，总量：1-2ug）
• 微生物基因组应用
  • 病原菌研究
    • 基因岛注、毒力因子分析
  • 耐药性研究
    • ARDB、CARD等抗生素抗性基因注释、分泌蛋白研究
  • 环境适应性研究
    • 碳水化合物酶注释、跨膜蛋白研究、比较基因组学分析
  • 发酵工程研究
    • 代谢通路研究、次级代谢产物
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