RNA-Seq数据分析流程
文章目录
- RNA-seq 数据分析流程
-
- 相关软件安装
- 下载数据
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- sra转fastq格式
- 数据质控
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- 数据质控，过滤低质量reads，去接头
- 比对
-
- 首先下载参考基因组及注释文件，建立索引
- 比对
- sam文件转bam
- 为bam文件建立索引
- reads的比对情况统计
- 计数 counts
- 差异基因分析
RNA-seq 数据分析流程
相关软件安装
可以安装 conda,在后续其他软件安装时非常好用。可自行百度进行安装
可根据文献调研，转录组数据分析所需软件列表：
质控
fastqc , multiqc, trimmomatic, cutadapt ,trim-galore
比对
star, hisat2, bowtie2, tophat, bwa, subread
计数
htseq, bedtools, deeptools, salmon
在安装之前可以先 search一下安装包是否存在
# conda search packagename
conda install -y sra-tools
conda install -y trimmomatic
conda install -y cutadapt multiqc
conda install -y trim-galore
conda install -y star hisat2 bowtie2
conda install -y subread tophat htseq bedtools deeptools
conda install -y salmon
软件安装时，可以使用conda一步安装，也可以自行百度，下载源码，解压后添加环境变量，使用。
但是在使用sra-tookit时出现了问题，因为已经提前用conda安装好了sra-tools,后面我在网页下载解压了sratoolkit,并且在环境变量中添加好了，导致两个软件版本不合，使用prefetch下载网页数据时总是报错。所以需要卸载其中一种，保持版本一致。
自行安装sratoolkit可参考：sratoolkit安装
下载数据
进入网页，得到SRR_Acc_list.txt
SRR957677
SRR957678
SRR957679
SRR957680
批量下载
wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录
cat SRR_Acc_List.txt | while read id; do (nohup prefetch ${id} &);done
#ps -ef | grep prefetch | awk '{print $2}' | while read id; do kill ${id}; done #在内地下载速度很慢，所以我杀掉这些下载进程
当显示所有下载都sucessful时，可以进行下一步
下载完成之后，文件会自动保存在目录：~/ncbi/public/sra/
mv ~/ncbi/public/sra/*.sra $wkd/rawdata
sra转fastq格式
使用fastq-dump
wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录
for i in $wkd/rawdata/*sra
do
echo $i
fastq-dump --split-3 --skip-technical --clip --gzip $i ## 批量转换
done
原始数据如果是双端测序结果，fastq-dump配合–split-3参数，一个样本被拆分成两个fastq文件，如果是单端测序，就只生成一个文件
数据质控
fastqc生成质控报告，multiqc将各个样本的质控报告整合为一个。
wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录
ls $wkd/rawdata/*gz | xargs fastqc -t 2
multiqc ./
得到结果如下：
├── [4.0K] multiqc_data
│ ├── [2.1M] multiqc_data.json
│ ├── [6.8K] multiqc_fastqc.txt
│ ├── [2.2K] multiqc_general_stats.txt
│ ├── [ 16K] multiqc.log
│ └── [3.4K] multiqc_sources.txt
├── [1.5M] multiqc_report.html
├── [236K] SRR1039508_1_fastqc.html
├── [279K] SRR1039508_1_fastqc.zip
├── [238K] SRR1039508_2_fastqc.html
├── [286K] SRR1039508_2_fastqc.zip
每个id_fastqc.html都是一个质量报告，multiqc_report.html是所有样本的整合报告
数据质控，过滤低质量reads，去接头
如果双端测序，运行一下代码，得到两列数据，config文件
mkdir $wkd/clean
cd $wkd/clean
ls /home/jmzeng/project/airway/raw/*_1.fastq.gz >1
ls /home/jmzeng/project/airway/raw/*_2.fastq.gz >2
paste 1 2 > config
并打开qc.sh,写入一下内容：
bin_trim_galore=trim_galore
dir='/home/jmzeng/project/airway/clean'
cat $1 |while read id
do
arr=(${id})
fq1=${arr[0]}
fq2=${arr[1]}
$bin_trim_galore -q 25 --phred33 --length 36 --stringency 3 --paired -o $dir $fq1 $fq2
done
单端测序：
wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录
mkdir $wkd/cleandata
cd $wkd/cleandata
ls /home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq/rawdata/*.fastq.gz >config
#ls /home/jmzeng/project/airway/raw/*_2.fastq.gz >2
#paste 1 2 > config
qc.sh
wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq/cleandata #设置工作目录
cd $wkd
cat config |while read id
do
arr=(${id})
fq1=${arr[0]}
# fq2=${arr[1]}
trim_galore -q 25 --phred33 --length 36 --stringency 3 -o $wkd $fq1
done
其他软件，对于单端测序和双端测序的不同用法，可以自行百度具体软件用法，都有解释，参考官方参数即可。
比对
首先下载参考基因组及注释文件，建立索引
基因组相关内容大家可以自行百度，但是参考基因组和注释文件一定要对应在同一个网站，同一个版本。可以下载的网站有UCSC,NCBI,ENSEMBEL
我是在ENSEMBEL上面下载的，一般选择primary参考基因组，注释文件选择scaff
复制链接地址后，axel 下载，非常快。下载后解压。
axel -n 20 ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-101/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
axel -n 20 ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-101/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.101.chr_patch_hapl_scaff.gtf.gz
ls
#Homo_sapiens.GRCh38.101.chr_patch_hapl_scaff.gtf.gz
#Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
##解压
gzip -d Homo_sapiens.GRCh38.101.chr_patch_hapl_scaff.gtf.gz
gzip -d Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
ls -lh
total 4.3G
drwxr-xr-x 2 meiling meiling 4.0K Nov 2 21:26 hisat2_index
-rw-r--r-- 1 meiling meiling 1.3G Nov 1 20:48 Homo_sapiens.GRCh38.101.chr_patch_hapl_scaff.gtf
-rw-r--r-- 1 meiling meiling 3.0G Nov 1 20:50 Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa
##建立索引
hisat2-build Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa hisat2_index/hisat_hg38
比对
star, hisat2, bowtie2, tophat, bwa, subread都是可以用于比到的软件
批量比对：
wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录
cd $wkd/cleandata
ls *gz|cut -d"_" -f 1 |sort -u |while read id;do
##单端测序
ls -lh ${id}_trimmed.fq.gz
hisat2 -q -p 10 -x $wkd/reference/hg38/hisat2_index/hisat_hg38 -U ${id}_trimmed.fq.gz -S $wkd/align/${id}.hisat.sam
##双端测序
#ls -lh ${id}_1_val_1.fq.gz ${id}_2_val_2.fq.gz
#hisat2 -p 10 -x $wkd/reference/hg38/hisat2_index/hisat_hg38 -1 ${id}_1_val_1.fq.gz -2 ${id}_2_val_2.fq.gz -S ${id}.hisat.sam
# subjunc -T 5 -i /public/reference/index/subread/hg38 -r ${id}_1_val_1.fq.gz -R ${id}_2_val_2.fq.gz -o ${id}.subjunc.sam
# bowtie2 -p 10 -x /public/reference/index/bowtie/hg38 -1 ${id}_1_val_1.fq.gz -2 ${id}_2_val_2.fq.gz -S ${id}.bowtie.sam
# bwa mem -t 5 -M /public/reference/index/bwa/hg38 ${id}_1_val_1.fq.gz ${id}_2_val_2.fq.gz > ${id}.bwa.sam
done
这里是演示多个比对工具，但事实上，对RNA-seq数据来说，不要使用bwa和bowtie这样的软件，它需要的是能进行跨越内含子比对的工具。
比对结果输出：
bash align.sh > align.log 2>&1
##打开align.log
###单端测序比对结果输出
-rw-r--r-- 1 meiling meiling 984M Nov 2 16:33 SRR957677_trimmed.fq.gz
File "/opt/software/hisat2-2.2.0/hisat2_read_statistics.py", line 182
length_map = sorted(length_map.iteritems(), key=lambda (k,v):(v,k), reverse=True)
^
SyntaxError: invalid syntax
20498068 reads; of these:
20498068 (100.00%) were unpaired; of these:
689901 (3.37%) aligned 0 times
17438548 (85.07%) aligned exactly 1 time
2369619 (11.56%) aligned >1 times
96.63% overall alignment rate
sam文件转bam
wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录
cd $wkd/align
ls *.sam|cut -d"." -f 1 |while read id ;do
samtools view -@ 8 -S {
$id}.sam -1b -o {
$id}.bam
samtools sort -@ 8 -l 5 -o {
$id}.sort.bam {
$id}.bam
done
#rm *.sam
为bam文件建立索引
ls *.sort.bam |xargs -i samtools index {
}
reads的比对情况统计
ls *.sort.bam |while read id ;do ( samtools flagstat -@ 1 $id > $(basename ${
id} ".bam").flagstat );done
计数 counts
首先安装featurecounts，这个软件已经整合到subread里面了
axel -n 20 https://udomain.dl.sourceforge.net/project/subread/subread-2.0.1/subread-2.0.1-Linux-x86_64.tar.gz
tar -zxvf subread-2.0.1-Linux-x86_64.tar.gz
cd subread-2.0.1-Linux-x86_64/
cd bin
pwd
#添加环境变量
计数
wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录
cd $wkd/align
# 如果一个个样本单独计数，输出多个文件使用代码是：
for fn in {
508..523}
do
featureCounts -T 5 -p -t exon -g gene_id -a $gtf -o $fn.counts.txt SRR1039$fn.bam
done
# 如果是批量样本的bam进行计数，使用代码是：
wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录
cd $wkd/align
# 如果一个个样本单独计数，输出多个文件使用代码是：
# for fn in {508..523}
# do
# featureCounts -T 5 -p -t exon -g gene_id -a /public/reference/gtf/gencode/gencode.v25.annotation.gtf.gz -o $fn.counts.txt SRR1039$fn.bam
# done
# 运行featureCounts对所有样本进行基因水平定量
# 如果是批量样本的bam进行计数，使用代码是：
# 设置featureCounts所需要的gtf文件位置（注释文件）
gtf="$wkd/reference/hg38/Homo_sapiens.GRCh38.101.chr_patch_hapl_scaff.gtf.gz"
featureCounts -T 5 -t exon -g gene_id -a $gtf -o $wkd/counts/all.id.txt *.sort.bam 1>counts.id.log 2>&1
#解释：-T 1：线程数为1；-p：表示数据为paired-end，双末端测序数据；-t exon表示 feature名称为exon；-g gene_id表示meta-feature名称为gene_id(ensembl名称)；-a $gtf 表示输入的GTF基因组注释文件；-o all.id.txt 设置输出文件类型；*.sort.bam是被分析的bam文件。featureCounts支持通配符*
# 这样得到的 all.id.txt 文件就是表达矩阵啦，但是，这个 featureCounts有非常多的参数可以调整。
cd $wkd/counts
# 使用multiqc对featureCounts统计结果进行可视化。
multiqc all.id.txt.summary
# 只保留all.id.txt文件的【基因名】和【样本counts】
cat all.id.txt | cut -f 1,7 |grep -v '^#' > counts.txt
运行结束：
得到以下文件：
# Program:featureCounts v2.0.1; Command:"featureCounts" "-T" "5" "-t" "exon" "-g" "gene_id" "-a" "/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq/reference/hg38/Homo_sapiens.GRCh38.101.chr_patch_hapl_scaff.gtf.gz" "-o" "/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq/counts/all.id.txt" "SRR957677.sort.bam" "SRR957678.sort.bam" "SRR957679.sort.bam" "SRR957680.sort.bam"
Geneid Chr Start End Strand Length SRR957677.sort.bam SRR957678.sort.bam SRR957679.sort.bam SRR957680.sort.bam
ENSG00000223972 1;1;1;1;1;1;1;1;1 11869;12010;12179;12613;12613;12975;13221;13221;13453 12227;12057;12227;12721;12697;13052;13374;14409;13670 +;+;+;+;+;+;+;+;+ 1735 0 0 0 0
ENSG00000227232 1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1 14404;15005;15796;16607;16858;17233;17606;17915;18268;24738;29534 14501;15038;15947;16765;17055;17368;17742;18061;18366;24891;29570 -;-;-;-;-;-;-;-;-;-;- 1351 7 1 2 3
ENSG00000278267 1 17369 17436 - 68 0 0 0 0
ENSG00000243485 1;1;1;1;1 29554;30267;30564;30976;30976 30039;30667;30667;31109;31097 +;+;+;+;+ 1021 0 0 0 0
ENSG00000284332 1 30366 30503 + 138 0 0 0 0
ENSG00000237613 1;1;1;1;1 34554;35245;35277;35721;35721 35174;35481;35481;36081;36073 -;-;-;-;- 1219 0 0 0 0
ENSG00000268020 1 52473 53312 + 840 0 0 0 0
ENSG00000240361 1;1;1;1 57598;58700;62916;62949 57653;58856;64116;63887 +;+;+;+1414 0 0 0 0
可以单个样本计数，之后在进行合并，使用Python脚本或者R语言merge
具体可以参考这里
或者直接批量比对，输出的all.id.txt即为合并后的表达矩阵。可以在这里选择注释，或者找完差异基因后在进行注释。
差异基因分析
后续需要在R里面进行差异基因分析，DESeq和edger里面自带标准化的函数，后续还可以进行KEGG，GSEA，GO富集分析