2019-11-27

转录因子研究套路

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1.基因的结构

1）编码区 Coding region

基因在结构上，分为编码区和非编码区两部分。真核生物的编码区是不连续的，分为外显子和内含子，在转录过程中会修剪内含子，并拼合外显子来形成转录产物。在原核生物中，基因是连续的，也就是说无外显子和内含子之分。

外显子 Exon：是在 preRNA 经过剪切或修饰后，被保留的DNA部分，并最终出现在成熟RNA的基因序列中。
内含子 Intron：在真核生物中，内含子作为阻断基因的线性表达的一段DNA序列，是在 preRNA 经过剪切或修饰后，被切除的DNA序列；去除内含子拼接外显子组成成熟的DNA

2）非编码区 Non-coding region

非编码区在对基因的表达调控中发挥重要作用，如启动子，增强子，终止子等都位于该区域，在人类基因中非编码区的占比超过90%。它们中的一部分可以转录为功能性RNA，比如tRNA（transfer RNA）, rRNA（ribosomal RNA）等；可以作为DNA复制，转录起始来对复制，转录和翻译起到调控作用；也可能是着丝粒与端粒的重要组成部分。

启动子（promoter）----能促进转录过程：启动子一般位于基因的转录起始位点，5‘端上游，在转录过程中，RNA聚合酶与转录因子可以识别并特异性结合到启动子特有的DNA序列。启动子本身并不转录而且也不控制基因活动，而是通过转录因子结合来调控转录过程。

（1）TATA框：其一致顺序为TATAATAAT。它约在基因转录起始点上游约-30-50bp处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基因转录始的选择，为RNA聚合酶的结合处之一。

（2）CAAT框（有时也缩写为CAAT box或CAT box）：其一致顺序为GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区

（3）GC框：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录调节区，有激活转录的功能。

此外，RNA聚合酶Ⅲ负责转录tRNA的DNA和5SrDNA，其启动子位于转录的DNA顺序中，称为下游启动子。

2.增强子（enhancer）------增强转录的作用
增强子有别于启动子的地方:1) 增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动;它能在两个方向产生相互作用 2)一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。

3.终止子 Terminator：终止子处于基因或操纵子的末端，给RNA聚合酶提供转录终止信号的DNA序列。

终止子与终止密码子的概念区分：二者在名称上相似，但是含义是截然不同的。终止子是处于基因的非编码区的一段DNA序列，用于终止转录。而终止密码子是在翻译过程中终止肽链合成的mRNA中的三联体碱基序列，一般情况下为UAA，UAG和UGA，不编码为氨基酸。

ATAAA
ATAAA 是 preRNA 在通过修剪后形成成熟mRNA 时在3'UTR产生ployA 是的加尾信号。但是这段序列并不是绝对保守，也可能为其他A富集的序列，比如AATAAA等。
回文序列 palindrome sequence
回文序列是双链DNA中的一段倒置重复序列，这段序列有个特点，它的碱基序列与其互补链之间正读和反读都相同。当该序列的双链被打开后，如果这段序列较短，有可能是限制性内切酶的识别序列，如果比较长，有可能形成发卡结构，这种结构的形成有助于DNA与特异性DNA与蛋白质的结合。
eg.5' GGTACC 3'
3' CCATGG 5'

2.preRNA

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为转录起始位点 Transcription start sites (TSS): 是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤（A 或G），即5’UTR的上游第一个碱基。

5’末端的序列称为上游,而把其后面即3‘末端的序列称为下游.

转录终止位点 Transcription termination sites (TTS)
转录起始位点是指新生RNA链最后一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基。当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来。
开放阅读框 Open reading frame(ORF)
ORF 是连续的一段密码子，其含有起始密码子（通常是AUG）和终止密码子（通常是UAA，UAG或UGA）。在真核基因中，ORF跨越内含子/外显子区域，其可以在 ORF 转录后拼接在一起以产生蛋白质翻译的最终mRNA。由于读写位置不同（对应不同的起始位点），ORF 可能翻译为不同的多肽链。上游即是5‘端的侧翼序列，下游则是3’端的侧翼序列。

3.RNA

5'UTR 与 3'UTR：这里需要注意的是外显子包含UTR区，也就是说外显子不只有可编码的序列，而且包含非编码序

UTR (Untranslated Region )，如果这段序列位于5'端，就称作5'UTR（5‘-untranslated region），也叫前导序列（leader）。相反若位于3'端，我们就叫它3'UTR（3‘-untranslated region），也叫尾随序列（trailer）。1978年，人类γ球蛋白mRNA的5′非翻译区被成功完全测序。1980年，又开启了人类α-珠蛋白基因中3′非翻译区的研究。有趣的是，虽然叫非编码区，但是5′非翻译区内的上游可读框却可以被翻译成多肽1 。

5'UTR 位于从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至起始密码子AUG，3'UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的前端

5‘Cap：也被称为7-甲基鸟苷酸帽，缩写为m7G。这种结构在RNA进出细胞核起到识别作用；可以抗5'-核酸外切酶的剪切，增加稳定性；促进5’端内含子的切除；在翻译过程中有助于核糖体对mRNA的识别和结合。
3’ PolyA tail：Poly A tail 由多个腺苷一磷酸组成，也就是它是一段仅含有腺嘌呤碱基的RNA 。这种结构可以避免细胞质中的酶促降解，并有助于转录终止，mRNA从细胞核中的输出和翻译。
CDS (coding dna sequence)：CDS 是基因中DNA或RNA为蛋白质编码区域，该区域通常开始于5‘末端的起始密码子并结束于3’端的终止密码子。生物体基因组编码区的总和称为外显子组。

套路课：转录因子研究套路

转录因子结合靶基因
由于还做了结合位点的突变

文章论证顺序：
TTF-1调节了胆固醇
TTF-1调节ABCA1的表达（分别做了RNA和蛋白）
ABCA1是TTF-1直接作用的靶基因
TTF-1促进胆固醇的流出（做表型）

创新的地方：主变量和因变量机制/主变量表型创新

文章数据理解：
1）主变量介导表型（Fig.1;Fig 5 一正一反；细胞动物）
2）两个表型相互嵌套（Fig 6 +IC50+加上了耐药的表型）
3）TTF-1影响ABCA1的表达（Fig2 ；qPCR筛选可能受TTF-1调控的脂代谢的差异表达基因，证明TTF-1正向调节ABCA1mRNA+蛋白+ 细胞动物验证）；从而负调节胆固醇的代谢（FIg.1)，最终导致他汀类的耐药
4）证明TTF-1的靶基因是ABCA1（直接机制的体现）-----用了荧光素酶实验（TTF-1过表达后可以显著提升ABCA1启动子的转录活性）+Chi-QPCR；分成三段验证TTF-1的结合位点（证明绿色是有结合转录活性的+突变后证明两个位点都是必须的）；Rescue出现了表型的回复

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转录因子论证格式：
1）功能基因：临床相关性（用了样本数据库--表达差异分析+生存曲线差异+临床相关性）----一正一反；细胞动物------分子机制（下游间接机制+
Rescue验证表型：使用了通路抑制剂）
2）lncRNA：高通量筛选+猜------筛到了分子，进行亚细胞的定位/表达----验证表型：细胞动物；一正一反-----分子机制：上游间接机制/下游间接机制/（三元变量）+Rescue
3）转录因子：细胞表型（一正一反）----间接机制（筛选了下游的分子；是否有差异表达的基因）----直接机制（荧光报告基因/结合位点验证：分为3段/蛋白与基因交互的Chi实验）----验证嵌套的第二个表型（细胞动物；一正一反）

转录因子---靶基因（直接机制）----表型（已知）---疾病（已知）
单变量：因此恒量中剩下
模：验证表型；细胞（高/低表达的细胞模型）动物；一正一反（RNAi+CRISPR）；Rescue验证表型是否可以回复
法：多实验佐证
标：多标志物佐证

二元变量：
1）调控关系：寻找下游或上游的调控靶分子；操作上游变量验证下游变量变化
原理：转录因子（活性增强或减弱）---靶基因表达变化----表型变化
回复验证：验证表型回复
过表达转录因子+抑制下游靶基因+看表型回复
沉默转录因子+过表达靶基因+看表型恢复
2）直接机制验证

转录因子的交互作用：Luciferase/Chi/EMSA
结合位点的验证：分段看结合活性/突变该区域看是否有变化

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