Week 7 同源重组-CRISPR

Lecture 13: CRISPR

Segment 1: Introduction to CRISPR

Segment 2: Review of Homologous Recombination

Segment 3: 真核生物中的同源重组Homologous Recombination in Eukaryotes

真核与原核的比较

Segment 4: Cell Cycle Terms

概览一些生物学中重要的术语和概念

complex of macromolecules chromatin大分子染色质复合物=DNA+RNA+蛋白质

chromosome染色体分为去凝聚和凝聚两种状态

人类卵细胞或精子中的染色体数目N=23

人类体细胞是二倍体，染色体数目2N=46

蓝和红称为同源染色体，同一基因的不同版本称为等位基因alleles,在该位置称为基因座locus

左图包含N chromosomes+1C content;中间的二倍体包含2N+2C；经过复制之后的姐妹染色体中包含2N+4C，

Segment 5: Cell Cycle

细胞有丝分裂分为M、G1、S和G2四个周期。这四个周期可以分为细胞分裂间期和细胞分裂期两大阶段。蓝色显示细胞分裂间期 即细胞用来准备细胞分裂的时期；黄色显示细胞分裂期 也就是细胞分裂发生的时期

G0期处于静息状态。这些细胞执行它们独特的功能，但是不会进行细胞生长或分裂，因为这些细胞不分裂。它们会有46条同源染色体或2N条染色体，没有姐妹染色单体，并且含有2C的DNA

G1期蛋白质鉴别出复制起点并向DNA上面装载多蛋白复合物。G1和G0期数目一样，在G1末期 有一个不可逆的点通常被称作限制点 (restriction point)，到了这个点 细胞会保证完成细胞周期的剩余过程，以及进入S期的转变

S期发生了DNA复制，形成了姐妹染色体，DNA含量变为4C

G2期是一个间期，可以让细胞为M期做准备，包括核实S期正确完成，染色体被完整而准确地复制，不需要再进行DNA修复或进一步DNA复制

M期就是mitosis有丝分裂期，分为图中的几个阶段

在M期DNA含量重新变为2C

Segment 6: 减数分裂重组Meiotic Recombination, Part 1

宏观上将减数分裂导致的DNA交换

Segment 7: 减数分裂重组Meiotic Recombination, Part 2

从微观上讲

Segment 8: Genome Editing and CRISPR, Part 1

CRISPR：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

CRISPR来自细菌基于DNA的免疫机制，上面是重复的序列，下面是来自噬菌体的特殊的序列

repeat region转录成RNA并整合成更大的蛋白RNA复合物

蛋白RNA复合物根据unique sequences来定位同源DNA并切掉DNA，一旦形成切口，就会被细胞中的其他核酸外切酶进一步切割。这是细菌抵御噬菌体的机制

class I 需要多个蛋白；而class II只需要1个蛋白，比如下图中的cas9 蛋白，一个就能定位靶基因。而且cas gene恰好跟repeat region相邻，只要找到了repeats,就能找到设计的蛋白

cas gene

Segment 9: Genome Editing and CRISPR, Part 2

为什么不会定向到细菌自己的基因呢？有两个解答，现仅以一个为例：

细菌DNA中含有黄色的可以定位噬菌体DNA的protospacer ，噬菌体DNA中包含PAM序列而细菌中不包含，所以该系统不会定向到细菌自己的基因

如下图所示，细菌转录本包含一段spacer（黄色）和一段repeat（灰色），左边有tracrRNA以反式激活CRISPR RNA，若tracrRNA不表达，则系统不工作。Cas9 蛋白实现剪切，Cas1和Cas2蛋白从噬菌体中获得新的序列，PAM是2-3个核苷酸长度的motif。因为细菌中没有PAM，所以不会被CRISPR/Cas9系统所剪切

CRISPR/Cas9系统

Segment 10: Genome Editing and CRISPR, Part 3

下图定位于target genome中，PAM是NGG，此图中的N为C，黄色的序列是上图中的protospacer，又称作guide RNA，而灰色的是repeat序列，又称作linker。蓝色的是tracrRNA。所以可以通过改变guide RNA 来定向识别想要编辑的基因。箭头所指向的是Nuclease Sites核酸酶位点。

CRISPR/Cas9系统的一个示例

靠近PAM的12个核苷酸序列必须精确，而后面的8个可以不精确

使用两个CRISPR/Cas9系统可以实现删除一段DNA序列，结果如下所示

deletion结果

通过同源重组，将蓝色的DNA整合到目标序列中

实验方法是将携带guide RNA的plasmid与repair template一起transfect转染到目的DNA中

然后蓝色的序列就被整合进入目的DNA中了

用途

You wish to use Cas9 to activate expression of a gene of interest. How should you modify your CRISPR gene?

1. mutate the gene encoding Cas9 to eliminate the nuclease activity核酸酶活性，这样就不会切割目的基因了。
2. Express Cas9 as a fusion protein融合蛋白 with a transcriptional activator转录激活因子。这样可以将转录激活因子带到想要表达的基因处，以激活该基因。

Additional CRISPR Video Resources from Our Colleagues
What is CRISPR? (2014)
Feng Zhang Explains CRISPR
Feng Zhang Lecture
CRISPR Applications to Human Health: SHERLOCK
一些文章
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