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CRISPR-Cas9系统为代表的基因组编辑工具发展迅猛，被广泛应用于定点编辑各种细胞、动物以及植物。此外，基于Cas9平台开发的单碱基系统（Base editor）最近几年如火如荼，最新开发的先导编辑系统（Prime editor）也正方兴未艾。
然而，到目前为止，只有少数Cas9在基因编辑中得到应用，例如最广泛应用的是经典的SpyCas9，其次是Cas12a（以前称为Cpf1），SaCas9，Cas12b等。事实上，Cas9核酸酶在微生物中含量非常丰富，但由于Cas9同源物数量众多而分析技术较复杂，一直以来只是零星地挖掘新的Cas9而缺乏大规模地分析。这也导致领域内长期以来对众多Cas9的进化关系，PAM多样性，切割活性，热稳定性等许多生化特性缺乏全面的了解。
近日，维尔纽斯大学教授、立陶宛科学院院士Virginijus Siksnys在预印本网站bioRxiv发表了题目为“Biochemically diverse CRISPR-Cas9 orthologs”的文章，系统比较了Type II Cas9在蛋白序列，tracrRNA等方面的同源性，并详细评估了79种新Cas9的体外生化特性， 提供了Cas9同源物全景式的见解，为从中开发新的基因编辑工具奠定了基础。
值得一提的是，Virginijus Siksnys教授虽然知名度不如Jennifer A. Doudna、张峰等CRISPR领域大牛，但他也是CRISPR的开创者之一，他带领的团队于2012年独立开发了CRISPR基因编辑技术。2018年卡夫里奖也授予了Virginijus Siksnys，肯定了其在CRISPR领域的开创性贡献。
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作者首先对目前所有的Type II Cas9进行进化关系分析，发现可分为10个分支。所有Cas9的蛋白长度从~1000到~1600不等，其中又以1100和1375的最多。为了全面的反映Cas9同源物的多样性，作者从Cas9进化树的10个主要支系中选择了47个Cas9同源物。然后，为了丰富生化活性和热稳定性，根据其理化特性，与嗜热宿主生物的亲缘关系等，又选择了32个Cas9同源物。总之，选择的这79种新Cas9基本全面覆盖了所有Type II Cas9分支，且相互之间同源性差异极大，以便进行后续分析和比较。
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作者接着对这79种Cas9的CRISPR位点进行分析，确定了相应一般来说具有至少两个不同碱基对的复合PAM识别的Cas9更常见。PAM识别的长度也在1-4个碱基对或更多之间变化，大多数Cas9同源物在3个或更多位置显示识别。Cas9的PAM序列主要是由其PID区域决定，因此又对Type II Cas9的PID同源性进行分析，结果发现可分为10类，每一类里的PAM序列较为相似。
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确定了每种Cas9的PAM后作者接着评估其体外切割效率。在5种buffer里进行体外切割测试，并比较不同Cas9对20nt和24nt spacer的偏好性。结果发现大多数Cas9同源物都适合20nt，但也有少数例如NsaCas9等更适合24nt。此外，绝大多数测试的Cas9（46/52）都表现出至少25%以上的体外切割效率，有作为基因编辑工具的潜力。
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对Cas9同源物的热稳定性进行分析，结果发现绝大多数Cas9热稳定性都超过37度，也有少数甚至超过50度，例如Cme2, Esp1, Nsa, Ain, Cme3, and Sth1A在50度都能切割，Nsa在60度都有切割活性。此外，SsaCas9在较低温度也能正常作用，在10度都能切割95%的产物。作者还提出像Cme2Cas9, 只能在~30到55度内有编辑活性，有可能可以用于开发温度控制的基因编辑工具。
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最后，作者对Cas9同源物的切割模式进行了分析，发现大多数Cas9切割DNA双链产生平末端，类似于SpyCas9和SauCas9。但也有一些Cas9产生粘性末端，都在非靶向链上，这表明可能在RuvC区域的切割位置或切割后修剪发生了变化，而靶向链上主要在PAM前的第3和第4位之间被切割。
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总而言之，作者首次应用无细胞生化筛选的方法大规模系统评估新Cas9的PAM和gRNA的需求，鉴定了79个具有至少7个不同类别的gRNA和50个不同PAM序列要求的Cas9同源物。这些新颖的G-、C-、A-、和T-rich 的PAM识别的新Cas9，极大地扩展了Cas9的基因组靶向范围。
此外，本研究对众多Cas同源物的进化关系，PAM多样性，切割活性，热稳定性，切割模式等许多生化特性进行了细致而全面地评估，为基因编辑领域提供了一个宝贵的原始工具库。相信在此基础上将来必然有一系列基于这些新Cas9的基因编辑工具将会得到开发，进一步扩展基因组编辑工具箱。
原始文献：
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.29.066654v1
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