2018-03-12

一，illumina测序相关知识

文库：DNA片段两端加上特定的DNA接头。

文库制作步骤：

1，超声波打断DNA

2，将断裂的两端用酶补平。

3，用taq酶在补平的3‘端加一个A碱基

4，连接酶连上特定的接头

桥式PCR:

1,芯片上的引物与DNA片段互补杂交。

2,加入dNTP和聚合酶合成互补双链。

3，加入NaOH碱溶液解链。

4，加中和液，DNA链的另一端就会和芯片上的引物互补杂交。

5，加NaOH碱溶液解链。

6，.......重复.....。

测序：

1，碱洗解链

2，冲掉脱下的链，留下共价键连接的那根。

3，加入测序引物，荧光标记的dNTP（特点：末端是被一个叠氮碱基堵住的。）

4，加入聚合酶开始合成，由于dNTP的特性，一次只能延生一个碱基。

5，将多余碱基冲洗掉，显微镜激光扫描，推出模板上是什么碱基。

6，加入化学试剂将叠N基团和标记的荧光基团切掉，3‘端的-OH暴露出来。

7，加新的dNTP和新的酶继续测下一个碱基

读（index）：

index：由于illuminate一次测序数据上亿，因此一次可以对不同的基因组同时测序，为了区别这些不同的基因组，在接头上插入了一段识别序列，叫做index。

读index的方法：

首先把刚读完的Read1的序列洗掉，加入read2的测序引物，read2引物会结合在index旁。

illuminate的另一个核心技术：双端测序

双端测序：即DNA的正负方向的链都读一遍，有效长度能增加一倍。

倒链的过程：

1，先合成DNA，得到互补链。

2，使用化学试剂切掉原来的链。

3，加上Read3的引物，读数据，可以得到得到很大的数据量。