ChIP-seq和CUT&Tag技术

ChIP-seq：利用染色质免疫共沉淀 + 高通量测序研究某种蛋白质结合的基因组区域

染色质由DNA、组蛋白等组成：

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DNA将组蛋白“打包”，起到调控基因比如激活/沉默的作用：

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1. 甲醛交联：将所有蛋白和其结合的DNA固定下来

包括目标蛋白：

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还包括其它蛋白：

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2. 染色质片段化：裂解细胞、DNA超声打断成小片段（~300bp）

3. 免疫共沉淀：利目标蛋白对应的抗体，吸附我们想要的片段形成抗体-蛋白-DNA复合物，洗脱不想要的

4. 目标片段富集：将抗体-蛋白从DNA上解离下来，洗脱抗体-蛋白，获得DNA片段

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5. 文库构建：测序

A. DNA两端加adaptor
B. PCR扩增
C. 检查library concentration
D. 测序

6. 数据质控+比对到参考基因组

最后得到reads比对到参考基因组x号染色题xx-xx位置

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7. 确定peaks

第一行：参考基因组
第二行：样本reads覆盖情况
第三行：control reads覆盖情况

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control样本很重要：在同一实验中不使用任何抗体吸附DNA片段（用于排除背景噪音）

参考：
https://www.bilibili.com/video/av54898325?from=search&seid=16669728483429689132
https://www.jianshu.com/p/a17f2870addd

由于ChIP-Seq实验过程中的甲醛交联、染色质片段化、免疫共沉淀以及文库构建等步骤繁琐且条件难以控制，常规ChIP-Seq实验需要大量细胞，且实验重复性差、信噪比低。往往辛苦培养了很久的细胞，挥霍一空后得到大量难以分析的数据，再次实验又得到一堆不同的无意义数据，甚至一个技术熟练的博士消耗大半年的时间毫无进展。这些技术上的困难限制了ChIP-Seq在DPI研究中的进一步应用，阻碍了表观基因组等领域的发展。

CUT&Tag技术

前不久，弗雷德哈钦森癌症研究中心的Henikoff博士在Nature Communication公开了CUT&Tag技术的详细结果与实验方案。与以往的ChIP-Seq、pA-MNase等方法相比，CUT&Tag技术方法简便易行，信噪比高，重复性好，需要的细胞数量少至60个细胞，且有望将ChIP-Seq做到单细胞水平。

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CUT&Tag技术的基本原理为：在抗体引导下，ChiTag酶仅在目的组蛋白修饰标志、转录因子或染色质调控蛋白结合染色质的局部进行目的DNA的片段化，同时添加测序接头，并释放到细胞外。由于绝大部分无关的染色质还留在细胞核内，因此整个实验的信噪比大幅提高，同时简化了实验步骤。该方法可一管式高通量应用，并可与单细胞测序平台“无缝”结合。ChiTag酶在打断基因组的同时加上接头，不需要繁琐的补平加A加接头，在一天内可以完成从细胞到测序文库制备全流程。

CUT&Tag和ChIP-seq比较：

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和单细胞测序结合：
由于PCR之前的反应都在细胞内进行，Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔，再加入带随机标签的引物进行扩增的办法，实现单细胞测序。

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https://www.nature.com/articles/s41467-019-09982-5
https://www.sohu.com/a/331749726_120054289

附：CUT&Tag 实验操作流程

ConA磁珠沉淀细胞可用低速离心代替。低速离心指600 × g离心3min，快速离心指<100 × g离心3s。

1. 细胞预处理（0.5-1h）
   1.1 室温下收集新鲜细胞置于EP管中并计数；低速离心，去溶液；
   1.2 管中加入细胞穿孔缓冲液重悬细胞；低速离心，去溶液；
   1.3 管中加入细胞穿孔缓冲液再重悬细胞，轻柔震荡并滴加Binding 缓冲液重悬的ConA磁珠，轻柔颠倒混匀5-10min；

2. 一抗结合目的蛋白（2h）
   2.1 快速离心EP管，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架上沉淀细胞，去溶液。
   2.2 EP管中加入预冷的抗体缓冲液将细胞重悬，轻柔震荡后置于冰上;
   2.3 每管中加入0.5-1μl一抗（抗体使用生产商推荐浓度），轻柔震荡；
   2.4 室温下将EP管置于摇床上孵育2h；

3. 二抗结合一抗（1h）
   3.1 快速离心EP管，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。
   3.2 将二抗1:100稀释于穿孔缓冲液，加入管中，轻柔震荡；
   3.3 室温下将EP管置于摇床上孵育30-60min；
   3.4 快速离心细胞，将管盖液体离心下来，EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。
   3.5 管中加入0.8-1ml 穿孔缓冲液，上下颠倒10次；
   3.6 重复步骤3.4、3.5两次。

4. ChiTag转座体结合抗体（1.5h）
   4.1 快速离心EP管，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。
   4.2 将ChiTag转座体1:250稀释于穿孔缓冲液2中，并滴加于细胞上，轻柔震荡；
   4.3 室温下将EP管置于摇床上孵育1h；
   4.4 快速离心细胞，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。
   4.5 管中加入0.8-1ml穿孔缓冲液2，上下颠倒10次；
   4.6 重复步骤4.4、4.5两次。

5. 激活ChiTag转座体，片段化目的DNA（1h）
   5.1 快速离心EP管，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。
   5.2 管中加入300μl ChiTag激活缓冲液，轻柔震荡；
   5.3 37ºC孵育1h。

6. DNA提取（1h）

7. PCR（1h），PCR之前需加入72ºC，5min步骤

8. DNA纯化（30min）

9. 上机测序