【三代】浅谈三代测序平台

2011年，美国Pacific Biosciences 公司正式发售第三代测序系统—PacBio RS。这是一台革命性的DNA测序系统，它融合了新颖的单分子测序技术和高级的分析技术，在测序历史上首次实现了人类观测单个DNA聚合酶合成过程的梦想。它有着其他系统无法比拟的序列读长，高达3000 bp。

       PacBio Sequel第三代单分子实时测序系统，不同于市面上其它基于模板PCR扩增后才能进行测序的系统，其核心技术是单分子测序技术，无需对模板DNA 进行扩增，使研究者第一次能够大规模、平行、连续地实时观测到单个DNA 聚合酶对每个模板序列的合成，进行碱基序列测定。在测序性能方面还具有以下突出优势：

1. 无于伦比的长读长（平均读长可达10-18kbp，最长60Kb）大幅提高定位准确性及拼接效率，大大简化后续的生物信息学数据处理。有利于阐释基因组所发生的变异以及大尺度结构重排等信息。

2. 单分子实时检测，无需PCR扩增，避免PCR引入的系统误差及对扩增片段的偏好性引起的信息缺失。每一条模板链都可获得相应序列信息，数据覆盖均匀，准确； 还可以检测包括稀有变异在内的各种突变型，反映各种突变型的频率。

3. 无需PCR，覆盖深度几乎不受序列中GC含量差异的影响，可测定高GC含量的区域，高度重复片段区域，100% A+T序列等基于模板PCR的测序技术难以逾越的区段。

4. 可同时获得聚合酶反应动力学信息，进行甲基化等修饰碱基的直接测定，还可区分不同基团的甲基化修饰及其它碱基修饰。

PacBio Sequel第三代单分子实时测序系统

与PacBio Sequel测序系统相比，PacBio SequelⅡ芯片支持8M SMRT Cell ，单张芯片测序通量提升了8倍，并可产出高精准度的长读长HiFi reads，碱基准确度可达99.9% 以上，具有测序通量更高、耗时更短、准确度更高、应用更灵活等特点。

PacBio SMRT测序原理

与二代Illumina测序平台相比，三代测序平台PacBio SequelⅡ应用SMRT 测序技术实现单分子实时测序。SMRT 测序原理是以SMRT Cell为载体，每个SMRT Cell上布满了数百万个零模波导孔（ZMW），测序时DNA聚合酶和一条模板分子被瞄定在ZMW孔底部进行反应，位于小孔底部的激发光能够激发核苷酸底物上的荧光标记，进而通过监测系统将荧光信号记录下来，从而获得碱基信息。整个测序过程 DNA 分子不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。

3.平台优势：

A.长读长、高产出

PacBio Sequel II 测序Polymerase reads 平均读长可达 25kb 以上，N50 在 35kb 以上，另外目前单个 SMRT Cell 产量有大幅提升，安诺基因目前CLR模式单个 SMRT Cell 的数据产量平均在 110Gb 左右，而CCS模式平均单个SMRT Cell 的数据产量位250Gb左右。

SequelII平台酶读长展示

B.高一致性准确度

PacBio SMRT 测序的原始数据错误率在 10%~12% 左右，但这种错误率是随机发生的，不存在系统偏好性，因此，PacBio测序可以利用自身的数据进行纠错，当数据深度达到 50X 左右时，一致性序列准确性超过99.999%（QV50），这也是ONT平台测序存在同聚物偏好性错误而无法自身进行校正无法比拟的。

C.均匀的覆盖度

大多数测序系统受到覆盖偏好性的困扰，从而导致富含AT或富含GC的DNA区域、高度重复序列等难以测序。这往往会导致不完整基因组覆盖率，甚至会在最终结果中造成高达15%的基因组信息缺失。单分子实时（SMRT）测序不需要扩增步骤，可实现对整个基因组的均匀覆盖。这样就能够测序回文序列和多样性程度低的基因组区域，同时长读长测序同样能够跨越复杂区域。