Effect of Selected Stilbenoids on Human Fecal Microbiota
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6412329/
https://doi.org/10.3390/molecules24040744
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主要背景知识与发现：
饮食中的酚类或多酚大部分是由人体肠道菌群代谢的。这些代谢物似乎赋予了酚类有益的健康作用。微生物组成会影响所产生代谢物的类型。相反，酚类化合物可调节微生物组成。理解这种关系可以通过酚类补充剂对健康产生积极影响，从而创造有利的结肠状况。这项研究探讨了六种类胡萝卜素（batatasin III, oxyresveratrol, piceatannol, pinostilbene, resveratrol, thunalbene即：batatasin，氧白藜芦醇，piceatannol，pinostilbene，白藜芦醇，thunalbene）对肠道菌群组成的影响。
- 用来自四个供体的粪便细菌厌氧发酵类胡萝卜素，在0和24 h收集样品，并通过16S rRNA基因测序评估对微生物的影响。统计测试在三个分类级别上确定了受影响的微生物。观察到的类胡萝卜素对微生物成分的调节作用包括：菌毛比拟杆菌的比率降低，菌属的相对丰度降低梭状芽胞杆菌及其对漆螺科的影响。与对照相比，经常观察到的效果是相对丰度的进一步降低。
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主要发现：
- Decrease in the Firmicutes to Bacteroidetes ratio, a decrease in the relative abundance of strains from the genus Clostridium, and effects on the family Lachnospiraceae.
- A frequently observed effect was a further decrease of the relative abundance when compared to the control.
- An opposite effect to the control was observed for Faecalibacterium prausnitzii, whose relative abundance increased.
- Observed effects were more frequently attributed to resveratrol and piceatannol, followed by thunalbene and batatasin III.
引言：
1. 类胡萝卜素的来源和作用
是植物来源的酚类化合物的一个子类，通常在饮食中食用，它们是红葡萄，花生，某些浆果和许多其他植物的成分。它们的平均饮食摄入量为1g /日[ 1，2，3 ]。最充分的研究stilbenoid是白藜芦醇，它走进了聚光灯与所谓的法国悖论，它是在缩减样本人群中冠状动脉心脏疾病的死亡率，尽管风险因素[的强大存在归因4，5]。进一步的研究将许多其他潜在的健康益处归因于白藜芦醇以及多种其他酚类，例如有效的抗氧化活性，心脏保护作用，神经保护作用，抗炎作用，预防癌症等。
2. 类胡萝卜素在肠道发酵
在植物中，酚类化合物通常与糖，有机酸和大分子（例如膳食纤维和蛋白质）结合，它们中的大多数不能在小肠中适当释放和吸收，到达结肠进行进一步的微生物发酵。在结肠水平，它们是通过常驻肠道菌群（GM）发酵的。
其中肠道微生物（GM）代谢它们成低分子量酚化合物，如酚酸，例如，可通过肠上皮细胞可以更容易地被吸收并进入肝用于进一步的生物转化或全身循环[ 7，8，9，10，11，12，13]。
这些微生物的生物转化可分为三个主要的分解代谢过程：水解（O-去糖基化和酯水解），裂解（C环裂解；去乳糖化；脱甲基）和还原（脱羟基和双键还原）[ 14 ]。
由GM这些生物转化，酚醛塑料出现由利于/ disfavoring某些微生物菌株，从而建立GM和酚醛树脂[之间的双向关系来调制GM组合物6，15，16，17，18]。未消化的酚类物质，以及与饮食无关的底物，例如内源性宿主分泌物，是肠道细菌代谢的主要底物，并可能以与益生元相似的方式影响转基因，通过抗菌作用改变微生物组成，和/或影响细菌粘附[ 2，19，20，21，22，23，24 ]。例如，绿原酸，白藜芦醇，儿茶素，和某些槲皮素衍生物已经表现出益生元样通过增加的比例代表影响双歧杆菌菌株[ 2，7，25，26，27]。抗微生物作用已被证明通过接种白藜芦醇和某些鞣花单宁通过抑制几种生长梭菌物种[ 2，12，17，28 ]。通过原花青素和绿原酸的细菌粘附的效果已通过一定的粘附力增强注意到乳杆菌菌株对肠上皮细胞[ 23，24 ]。
据我们所知，除了白藜芦醇和一些关于苦瓜酚的研究（这两者都是公认的植物来源的酚类化合物），关于斯蒂芬苯对转基因的影响的信息很少。除了2016年关于重复施用Stilbenoid对转基因的影响的研究外，其余研究主要集中在评估单剂量效应上，主要针对可培养的微生物菌株。前者的发现表明，在应用白藜芦醇和viniferin后，GM组成发生了很大变化，尤其是肠杆菌的富集和双歧杆菌的减少[ 29 ]。
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这项研究的目的是评估六种类胡萝卜素酚类药物（batatasin III（Bat），氧白藜芦醇（Oxy），反式白藜芦醇（Res），piceatannol（Pic），pinostilbene（Pino）和thunalbene（Thu）的效果;相应的化学结构在图1）在膳食中的相关浓度的GM。使用体外粪便发酵（FFM）系统，将这些类胡萝卜素与来自四个供体的人类粪便细菌一起发酵。对GM组成的影响基于16S rRNA基因测序结果。
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2.1 厚壁菌门与拟杆菌（F / B）的比率
人类肠道菌群中最丰富的门是厚壁菌门和拟杆菌，它们通常占肠道菌群总数的90％以上[ 35 ]。
但是，本研究并非如此。厚壁菌门最多，其次是放线菌，根据供应者的不同，拟杆菌属排在第四或第五位。一种可能是加工过程中使用的一种试剂盒可能比拟杆菌更对种门更敏感，或者与通常单独在粪便中发现的细菌相比，这些细菌在体外培养过程中的相对丰度更高。但是，仍然可以评估这两个门的比率。增加的F /在人和小鼠肠道菌群B比一直被以更高的肥胖与疾病的发生有关[ 36，37 ]。
白藜芦醇先前已经显示降低该比率[ 2，27，38 ]，我们的研究结果支持这一点。同样，其他测试的类胡萝卜素也降低了F / B比，如图2。在24 h（121±73）时，Res，Bat和Thu的比率（分别为61±23、49±22、96±53）低于对照组。有趣的是，皮诺（Pino）显示增加（227±127），而Pic在24 h保持与对照大致相等（131±98）。的反应是在厚壁菌门的相对丰度的减少和增加的拟杆菌，这与其它研究[发现是一致的结果2，7，27]。对于Firmicutes，在用所有测试的类胡萝卜素治疗后，其相对丰度降低（-2.9％±0.03％）在24小时时均低于对照（-4.6％±0.03％），在Oxy和Pino（-分别为1.5％±0.03％和-0.7％±0.02％）。对于拟杆菌类，用除Pino（51.0.2％±0.00％）以外的所有测试的类胡萝卜素处理后，相对丰度增加（Bat 278.0％±0.02％; Oxy 198.1％±0.00％; Pic 86.0％±0.05％; Res 195.6％±0.04％; Thu 300.3％±0.01％）大于对照组24 h（68.0％±0.04％）。
2.2 最多和最少的物种
在测试的粪便样品中总共检测到230种细菌物种实体。该数字包括只能归为更高分类标准一部分的未识别物种。例如，来自不明属的不明物种属于梭菌科。对于未鉴定的克里斯滕氏菌属，最低的检测到的相对丰度为0.00047％。
确定每个测试样品中相对丰度最高的五个物种。它们占总相对丰度的53％至66％，并且总共包含11种不同的物种（表格1）。因此，在最丰富的分类单元中似乎有一定的一致性，而没有太大的可变性。
反过来而言，在相对丰富度最小的五个物种中，一致性较低，变异性更大，因为它包含27个不同的物种（附录A，表A1）。
- 重要的是不要忽略最不丰富的物种，因为它们的低丰度不一定与它们功能的重要性相关。如Cueva等人所述，存在的微生物数量较少，但具有特定的功能，可能是了解个体对生物活性化合物（如酚类）消耗的反应的关键。
有些代谢功能似乎可以通过多种物种实现，而其他功能只能通过特定的几种来实现[ 15 ]。例如，已经发现在27个物种中鉴定出的溴化鲁美球菌是丁酸盐（一种短链脂肪酸）的生产者，该功能似乎比乙酸盐的种类更少[ 39 ]。
2.3 相对丰度的变化(Phylum, Family, Species)
基于两个比较，参数和非参数统计测试均用于在门，科和物种级别上识别感兴趣的分类单元。统计测试被用作识别可能受到严重影响的分类单元的工具，并且由于样本量较小（四个供体），因此不应将其解释为具有确定的统计显着性（对于p值在范围内的人）。所识别的分类单元报告至少一个p的p <0.075比较1和比较2的值（配对样本t检验和/或Wilcoxon符号秩检验）。比较1以24小时对照的相对丰度为基线，并将此值与六种类胡萝卜素发酵中的每一个进行比较。比较例2将对照0 h和对照24 h之间相对丰度的变化（增长或下降）幅度用作基线，并将此值与对照0 h和六个类til类发酵之间的变化幅度进行比较。
图3以按照系统发生距离排序的系统发生树的形式显示这些已识别的分类单元。相应的p值在附录A中列出，表A2，相应的相对丰度箱图显示在 图4。每个比较（1＆2）分别显示在附录A中，表A3和 表A4，并列出其他分类单元。附录A中可以看到门廊和家庭级别的细菌组成的簇状条形图，图A1 和 图A2。 表2 显示我们的研究如何与其他研究中发现的关于类胡萝卜素对特定分类群的影响的发现和观察结果进行比较。
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图3
所有已鉴定细菌菌突的系统发生树。该树通过系统发育距离来分类，因此越接近它们在树中，越接近它们在遗传上是[ 41，42 ]。对于比较1和2，至少以一个p值（配对的样本t检验和/或Wilcoxon秩和检验）的红色表示为至少 在某些经测试的类胡萝卜素下，几个分类单元的相对丰度降低了。与Res，Pic或Thu进行的24小时对照相比，最常观察到的反应是特定分类群的相对丰度进一步降低。例如，对于梭菌属。Ctrl24的下降幅度为-54.2％±28.8％，而Pic和Thu所引起的下降幅度更大，分别为-62.9％±28.0％（t（3）= 3.960，p = 0.029）和-79.3％分别为±22.6％（t（3）= 3.901，p = 0.030）。观察到了类似的反应，尽管对于 Lachnospiraceae 和Coprococcus sp 。，Collinsella aerofaciens和Lachnospiraceae Gen.sp。在属水平上，在我们的研究中，所有测试的类胡萝卜素中梭状芽孢杆菌的含量均下降。先前的发现，列于表2，观察到，从该属数种梭菌，其中既包括共生和有害物种，已被证明与白藜芦醇降低[ 2，12 ]。 观察到的第二个反应是相对丰度降低，而24小时对照增加。这是通过三个物种Ruminococcus sp。观察到的。（在蝙蝠下为−3.2％±69.1％，t（2）= 4.448，p = 0.047;在Pic下为−7.0％±69.4％，t（3）= 8.253，p = 0.004; −41.1％±50.9％，t（ 3）= 1.953，在Thu）下p = 0.146 ，Ruminococcus sp.。（-3.3％±12.7％，t（3）= 3.947，p = 0.029（在Res下））和Coriobacteriaceae Gen.sp. （在Oxy下为-0.9％±94.2％，t（2）= 6.272，p = 0.024;在Pic下为-3.7％±90.6％，t（3）= 3.261，p = 0.047; -39.2％±10.0％，t（ 3）= 1.726，在Thu下p = 0.183），而在24 h控制下它们分别增加（分别为27.8％±80.6％，32.2％±68.5％，15.5％±20.8％）。关于Ruminococcus，这未必是根据最近的研究具有良好的反应，它指向长链膳食纤维降解剂的比例很高，丁酸盐产生菌如瘤胃球菌属，真杆菌和双歧杆菌作为健康肠道菌群的一部分。11，40，41，42 ]。在瘤胃球菌属以前被确定为三大类群之一，除了杆菌和普雷沃，定义enterotype概念，这可能在应答解释变异干预研究[/无应答者帮助43]。关于肠杆菌科，已经注意到，许多代谢酚类的物种都属于这个家族，但是，其潜在的健康意义仍然知之甚少[ 6 ]。然而，该家族中的一个重要的方面是，所有标识的小号-equol生产菌，除属乳球菌属，属于它[ 44，45 ]。 观察到的第三个响应是相对丰度降低，而24 h对照也降低了，但幅度更大。Blautia obeum（最近被重新分类，以前的名称为Ruminococcus obeum [ 46 ]）被观察到。Blautia因其相对较高的丰度而被认为是Firmicutes门的主要代表之一[ 15 ]。该物种的硫丹相对丰度有所降低（-5.6％±32.1％，（t（3）= 3.763，p = 0.033），但在24 h时幅度低于对照（-29.8％±35.6％）。Blautia的减少，在属水平，也报道了对小鼠进行的研究供给的富含酚的在人类粪便发酵研究的研究西红柿的饮食，以及来自酸樱桃[酚类的消费后26，31 ]。这些发现以及我们的研究表明，某些酚类物质可能会导致该属的减少，但幅度要比没有酚类时少。该分类单元似乎也是一种产生丁酸盐的微生物，其减少与丁酸盐的产生减少有关[ 47 ]。 鉴定出的分类单元中有八类属于Lachnospiraceae。在该家族中，测试的类胡萝卜素没有一致的反应，但是，最常见的反应是相对丰度降低。在一项研究中也观察到了这种减少，在该研究中，大鼠的饮食中补充了类雌二醇类萜。在该研究中，与基线水平相比，每个测试组的茅草科都明显减少了[ 33]。 观察到与在24小时的控制没有变化中的相对丰度的增加Faecalibacterium prausnitzii RES下（36.6％±88.0％，T（3）= -2.806，p值= 0.068下RES），24小时对照（-0.5％± 62.5％）。该物种先前已被鉴定为产生丁酸盐的细菌，并被认为是有益的。丁酸盐的产生似乎是通过诱导健康结肠细胞增殖来维持结肠上皮的关键。纤维含量低的饮食，例如我们的捐赠者在捐赠样品之前要接受的饮食，与丁酸盐的低产量有关。一项研究表明，正常饮食的人中F. prausnitzii和丁酸的比例与F. prausnitzii的减少之间有很强的正相关关系。上切换到无纤维或纤维补充饮食与粪便丁酸[还原相关47，48 ]。肠上皮是主体的网站丁酸封存，以及低生产丁酸已经被连接到炎性疾病，如溃疡性结肠炎[ 39，49 ]。与广泛分布的产生乙酸盐的细菌不同，似乎产生丁酸盐的细菌较少，如普氏链球菌，直肠梭状芽孢杆菌，哈氏肠杆菌和布罗姆氏菌[ 38 ]。据观察，以植物为基础的，富含纤维的饮食会增加，因此，作为植物化学物质的类胡萝卜素有望增加其丰度。我们的发现支持白藜芦醇。 在Thu（8.2％±40.6％，t（3）= −2.244，p = 0.111）下，在24 h的条件下，相对于相对丰度的增加，Ruminococcus gnavus在24h的控制下降低了（-12.9％± 30.7％）。观察到的p值以及方框图图4，表明R. gnavus的增加不如*F. *prausnitzii明显。这两个分类群的倾向于在炎症性肠疾病如克罗恩病[被相当减少50，51 ]。 尽管仅在我们的一个捐献者中检测到了它，但据观察到白藜芦醇可增强粘液阿克曼（Akkermansia muciniphila）。以前已观察到该物种被萜烯增强，其显示出与白藜芦醇相似的细胞作用。其中之一是，两种酚都被认为可以在分子水平上模拟热量的限制作用，从而修饰肠道菌群，特别是增强黏液曲霉的生长[ 33 ]。 这些发现强调了试图将分类标准降至最低以更好地表征肠道菌群的重要性。从我们的研究中可以看出，同一家族水平内的物种在反应方面并非都统一。较高的分类标准非常有用，并且可以使实验和数据处理更易于管理。但是，在对每个分类单元的成员进行概括时必须小心。 无论微生物群反应是相对丰度的下降还是相对丰度，其影响更多地归因于白藜芦醇和Piceatannol，其次是紫杉醇和batatasin III。这种差异可能与它们的化学部分有关。所有的类胡萝卜素均具有基本的C6-C2-C6结构，仅在-C2-上存在或不存在CC双键以及官能团的类型和位置（主要是羟基（-OH）和邻甲氧基）（ -OCH 3）在芳环上。在酚醛树脂，-OH基团发挥它们的生物活性，并通过-OCH它们的取代了重要的作用3基团已被证明降低其生物活性[ 52，53，54]。-OH基团是良好的氢供体，被认为具有很高的反应性和强力的自由基清除剂，是白藜芦醇一般抗氧化机理中的关键，并且已显示-OH基团较多的酚类化合物比-OCH基团具有更高的酶抑制能力。3组[ 53，54，55，56，57 ]。酶抑制能力也被证明是由上所述-C 2 C = C双键，其减少酶抑制[氢化的影响54，58，59，60]。这表明，具有-OH部分和-C2-上有CC双键的酚类可能比具有-OCH 3部分并且在-C2-上没有CC双键的酚类更具生物活性。白藜芦醇和Piceatannol分别具有三个和四个-OH基团，以及-C2-上的CC双键。在本研究中，它们是最常归因于GM的两种类胡萝卜素。接着是硫氧萘，其被O-甲基化并且在-C 2-上具有CC双键，以及巴他他星III，其被O-甲基化并且在-C 2-上没有CC双键。关于脱甲基，最近的研究报道了Blautia sp。对酚姜黄素的脱甲基结肠代谢产物。MRG-PMF1 [ 61 ]。硫磺烯是O-甲基化的，如先前报道的Blautia sp.。硫磺烯下的相对丰度降低了，但幅度小于对照。关于CC双键还原，Bode等。结果表明，Slackia equiifaciens和Adlercreutzia equolifaciens能够通过还原CC双键将白藜芦醇代谢为二氢白藜芦醇，但无法鉴定出产生其他两种代谢物的-OH裂解细菌[ 8 ]。通过GM的C = C双键的还原也已显示对其他酚类如异黄酮和hydroxycinnamates，而-OH裂解为木脂素和酚酸[ 19，62，63，64]。化学部分如何通过微生物菌株和生物活性（如抗氧化剂活性，酶抑制，群体感应等）影响代谢产物的产生，不在我们的研究范围内；尽管如此，它仍是进行中和未来研究的重要途径。 对此类转基因研究结果的解释应考虑个体间变异性的概念。该概念在文献中是众所周知的，最著名的例子是微生物群为S-雌马酚植物雌激素的生产者或非生产者的个体之间的差异。口服小号-equol在改善某些心血管疾病的生物标志物的结果，但只有那些谁是生产者[ 20，47 ]。尽管我们的样本量很小，但供体GM组成之间的差异可以在图A1 和 图A2。例如，与其他三个供体相比，供体D2似乎具有非常不典型的微生物组成。2.3.1 相对丰度的降低
2.3.2 相对丰度的增加