海藻糖含量测定方法

在进行生化测定时候，很多人疑惑到底做不做标准曲线，在生化测定试剂盒的说明书中，一般都会提供两种测定的方法：

1. 通过建立标准曲线，然后计算出样品浓度与OD值之间的对应关系，然后测定样本的OD值，计算出所含样品的浓度。
   

   

   BCA法测定总蛋白标准曲线
   
   评价：采用标准曲线是最为严谨科学的做法。因为吸光值和浓度之间的对应关系，可以通过绘制标准曲线，来拟合理想状况下的吸光值和浓度的关系，尽可能的减小了误差。标准曲线最好每次独立实验都做一次，因为仪器本身、生物反应条件、操作等等因素可能影响到测量数据的准确性。

2. 通过已知浓度的标准液作为基准（标准曲线上线性范围内的某一点），然后根据公式计算出样品大致的浓度范围。

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  葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量

评价：采用标准样品，无需绘制标准曲线，简单方便，在不需要知道精确测定值而只进行对照处理归一化上，尤为适用。

海藻糖含量测定方法：

市面上大多数海藻糖测定试剂盒是无法检测混杂有其他糖成分的海藻糖，如索莱宝、Boxbio，所以对产品选择时候一定要擦亮眼睛。

1. 三氯乙酸提取法。
   利用三氯乙酸对海藻糖的提取专一性，提取海藻糖，然后再用蒽酮法进行定量检测
   评价：三氯乙酸提取效率低，一般在18.9%左右，而且提取受三氯乙酸浓度、提取温度和时间等因素影响。
2. 海藻糖酶降解法。
   采用Trehalase 特异性将海藻糖降解为葡萄糖，然后对Glucose含量进行测定，减去未加酶（PBS）处理样本的Glucose背景值。前提是通过已经浓度的海藻糖标准品，采用相同的方法绘制标准曲线。
   评价：测定过程多了一步酶处理过程，而且海藻糖酶价格昂贵。此外，也有文献采用Glucose + Trehalose，即酶消化后测定总糖，来表示体内总糖的含量值，而不去单独计算海藻糖和葡萄糖的各自值。

image.png

纵坐标: OD= ODTrehalase-ODBuffer
横坐标: 海藻糖浓度

综合，修改后的步骤如下：
以昆虫血淋巴测定为例：

Hemolymph	1ul
Citric acid	7ul
Trehalase	1ul

37℃孵育2h，然后加入90ul H2O混匀。
取2ul至200ul工作也中进行测定