基于FDA批准的HRD 14gene的中国前列腺癌cfDNA数据评分系统测试

一.DNA损伤修复与PARP抑制剂药物

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     随着今年5月份以奥拉帕利（olaparib）为代表的PARP抑制剂类药物在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌之外的第四个癌种——去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者中的获批， 以同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）为代表的DNA损伤修复（DNA damage repair，DDR）通路基因在不同癌种以及同一癌种的不同样本类型（组织、cfDNA）中的HRD评分计算方式及cutoff值的确定的必要性就显得越发重要。

截至2020年初国内外获批的PARP抑制剂药物及适应症汇总

PARP抑制剂作用机理——合成致死

    2018年一项关于DNA损伤修复缺陷的TCGA数据挖掘研究进一步证实：与TMB类似，HRD score在卵巢癌、前列腺癌等数33种肿瘤间波动范围较大，因此不存在一个适用于所有类型肿瘤的HRD score阈值。

HRD score在TCGA 33个癌种中的分布

   目前在前列腺癌方面，与在卵巢癌上获批的Myriad Genetics myChoice HRD产品不同:

a.FDA批准的HRR 14 genes主要通过是突变否在COSMIC数据库中有注释信息、以及编码区域的剪切、移码/截断突变、纯合子缺失、重排等突变类型的方法来判断是否为HRD positive,并没有结合germline/somatic突变频率以及各基因贡献度差异得到具体的HRD score cutoff，以便评估患者对奥拉帕利潜在获益的不同等级；

b.样本类型方面该标准也是面向组织样本，SNV/INDEL 突变频率下限都在5%以上，不太适用于低频突变为特征的cfDNA样本；同时在药物研发临床入组方面，一项胃肠道肿瘤的研究显示，相较于组织样本样本，cfDNA样本可显著缩短筛选患者入组临床试验的时间（11天 vs 33天）并提高试验入组率（9.5％ vs 4.1％），因此，相较于组织样本，cfDNA样本在以后的药物研发临床入组方面的重要性回愈发突出，针对cfDNA样本的HRD score计算方法的确立也就不言而喻。

FoundationOne®CDx审批报告中HRR的评估条件

FoundationOne®CDx审批报告中HRR gene 突变频率的LoD设置

二. 基于中国前列腺癌患者cfDNA测序数据的HRD score 计算

      因此，我们使用早期自行积累且通过质控后的70例中国人群前列腺癌患者（以CRPC为主）cfDNA Panel测序数据：

a.安捷伦捕获建库试剂盒（单向10bp UMI分子标签）；

b. 原始深度10000X,c.UMI去重后深度>=1000X；

c. 数据涵盖FDA批准的14个HRR gene以及其它29个HRD相关gene;

d.SNV/INDEL LoD>=0.3%&&Mut readcounts>=2；  

 进一步结合各基因贡献度、germline/somatic 突变频率以及Reve/PrimateAI等7个数据库对突变有害/可能有害性的判定设定计算方法，分析70例样本HRD score的区间分布范围。

2.1 HRD score分布范围分析

基于FDA 14genes的 HRD score阈值分布分析

基于本地43genes的HRD score阈值分布分析  

      自定义HRD score计算方法在本地70例前列腺癌cfDNA 样本的评分结果显示：不论是以FDA批准的奥拉帕里伴随诊断相关的14个HRR基因，还是本地43个HRD相关genes为准，都可以将患者明确分为Low,Middle,High三组；而且即便按两种gene数目分别计算，也并不影响患者原来的分组结果，显示出了较高的分类稳定性。 另外，High组的患者比例约17%，处于可从PARP抑制剂药物获益的前列腺癌患者群体比例范围内（~25%）。           

      但以上HRD score分类结果对以奥拉帕利为代表的PARP抑制剂在前列腺癌患者群体中的实际指导意义，还需要后续药物临床实验跟进验证。鉴于F1CDx 产品对14个HRD genes 的相关突变也只是做了方法学上的平行验证，尚未涉及药物临床研究，后期的相关药物临床试验也是必要的。  

F1CDX产品关于HRD 14 genes突变检测结果的验证

2.2.补充——ctDNA 比例与HRD score 相关性分析验证

>cor.test(cfDNA$ctDNA_percent, cfDNA$HRDscore_FDA_14_genes, method = "spearman")

Spearman's rank correlation rho

data:  cfDNA$ctDNA_percent and cfDNA$HRDscore_FDA_14_genes

S = 49718, p-value = 0.283

speraman相关分析显示：自定义的HRD score计算方法得到的HRD值与ctDNA比例不存在显著相关。

三. 讨论

        与HRD score相关的TCGA数据挖掘结果相比，在前列腺癌上，本地HRD score分布范围显得略高于文献报道结果。除了直观层面的样本类型、计算方法的差异外，纳入突变种类差异也是一个潜在的重要影响因素，本地Panel在设计时，所有gene除exon+5'/3'UTR区域外，进一步结合Clinvar、COSMIC以及其它7个突变分类注释软件，额外引入了相关gene内含子区域的所有有害/可能有害突变以与DNA损伤修复通路紧密相关的BRCA1/BRCA2 为例:两个gene内含子区域在Clinvar数据库明确标注有害/可能有害的突变就有41个。TCGA数据以WES 全外显子为主，而本地HRD score计算时同时纳入了线管gene内含子区域突变信息，一定程度上拉高了阈值。

         而这些在乳腺癌/卵巢癌等其它癌种中明确注释为有害/可能有害的内含子区域突变，在前列腺癌等其它癌种中是否也是有害的？是否应纳入计算以及需要给与多高的权重，目前还未找到实质性依据，但至少提示前期的Panel设计直接影响HRD score 的计算，而且在Panel设计之初先纳入全面的位点信息，后续分析计算、临床入组研究以及IVD申报时也会多一份保障。因此，下一节对NGS gene检测Panel设计方法做简单分析。

Clinvar数据库中收录的BRCA1/BRCA2 gene内含子区域的有害/可能有害突变