今天和大家分享的是2020年发表在CancerCell Int（IF：3.439)上的一篇文章，“Constructionof a novel gene-based model for prognosis prediction of clear cell renal cellcarcinoma”。作者使用TCGA透明细胞肾细胞癌（ccRCC）数据集作为测试集，探索差异表达的基因，使用单变量Cox比例风险回归，LASSO算法和BSR，通过多元cox系数乘以基因表达来计算风险评分，构建了5-预后基因的风险评分模型。联合使用GEO的GSE29609数据集作为验证集，验证该风险评分模型。接着将该预后评分模型与临床参数结合，构建诺模图，通过tROC曲线对此评估。
Construction of a novel gene-based model for prognosis prediction of clear cell renal cellcarcinoma
基于新基因的透明细胞肾细胞癌预后预测模型的构建
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一、 研究背景
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾细胞癌最常见的亚型，发病率及死亡率均不乐观。因此，一个可靠的预后预测工具可以帮助临床做出更好的治疗决定。作者通过构建一个基于多个预后相关基因结合临床参数的模型，更直观准确地预测患者的总生存期。
二、 分析流程
三、 结果解读
1. 差异表达基因的鉴定
TCGA ccRCC（包括肿瘤和癌旁组）的mRNA谱的原始技术数据经过标准化，通过Voom转化进行分位数过滤，使用R的limma软件包对差异表达基因（DEGs）进行分析。
2a：PCA分析，显示肿瘤组织和癌旁组织的转录组水平存在显著差异。同时TCGA KIRC数据集没有批次效应。红点代表正常簇，蓝点代表肿瘤簇。
2b：与正常组织相比，ccRCC表达差异的火山图。总共鉴定出399个DEGs，包括71个上调基因和328个下调基因。红点代表显著上调基因(p<0.05，logFC> 4)，绿点表示显著下调基因（logFC<-4，p <0.05）。
2c：ccRCC中排名前20位的DEGs的热图。
图2：筛选DEGs的数据处理。
2. 预后相关的差异表达基因的筛选和验证
作者对RNA测序的原始数据进行log2 TPM标准化处理，使用单变量Cox比例风险回归分析获得40个重叠候选基因。然后使用R的glmnet软件包进行LASSO回归，十折交叉验证获得最佳的λ值。通过最佳子集回归（BSR）获得最佳的5个预后基因模型：PADI1，ATP6V0D2，DPP6，C9orf135，PLG。
3a：作者对训练集数据进行单因素Cox回归分析。发现2408个（HR>1）的预后相关基因和4035个（HR<1）的预后相关基因，分别将这些预后相关基因与71个上调基因和328个下调基因取交集。获得40个重叠候选基因（OCG）：其中包括HR>1的9个DEGs和HR <1的31个DEGs。
3b和c：19651个蛋白质编码基因的LASSO系数图（b），（c）十折交叉验证的LASSO回归，使用最小的部分似然偏差对应获得最佳的λ值，与DEG中的14个与OS显著相关的基因有关。
图3a-c：ccRCC中5个重要预后基因的鉴定
4：以上述5个基因的表达量的中位数为分界，将训练集样本分为高表达组和低表达组，进行KM生存分析。
可见：PADI1的过表达，ATP6V0D2，DPP6，C9orf135和PLG的低表达与ccRCC患者的预后不良有关（p<0.05）
图4：PADI1，ATP6V0D2，C9orf135，DPP6和PLG的KM生存分析图
3. 表达谱，IHC和预后相关基因的遗传改变
作者对这5个预后基因表达谱进行分析，在补充材料5中展示了这5个基因的表达水平与AJCC分期内的各个组织病理学信息，淋巴结转移，肿瘤分期相关性。补充材料3中展示了在cBioPortal数据库（http：// cbiop ortal.org）中检索的这五个基因的遗传改变信息。
3e：肿瘤与正常肾脏组织之间的5个预后基因的表达谱：表明与正常组织相比，ccRCC中PADI1显著上调，而ATP6V0D2，DPP6，C9orf135和PLG显著下调。（p<0.001）
3f：肿瘤和正常肾脏组织中五个基因的IHC图像，图像是从人蛋白质图谱在线数据库（http：//www.prote inatl as.org）中检索而来的。DPP6蛋白的表达没有发现差异。
图3d-f：ccRCC中5个重要预后基因的表达数据
4. 5-基因预后模型的建立和评估
通过多元Cox比例风险回归模型得到5个最佳预后基因的回归系数，采用线性组合的方式将各个基因的表达水平和系数进行组合，得到风险评分公式：风险评分risk score = 0.09862331 * Exp(PADI1)−0. 09526638 * Exp(ATP6V0D2)− 0.11493839*Exp(DPP6)−0.06144184 * Exp(C9orf135) −0.11164739*Exp(PLG)。
3d：对5个预后基因进行多变量Cox比例风险回归分析，以确定每个基因对于ccRCC患者是否可以显示出显著的预后价值。
5a：风险评分曲线：计算每位患者的风险评分，使用R软件包“survminer” 获得中位数，并根据此将患者分为高风险组（n = 176）和低风险组（n = 177）。
5b：展示了训练集中患者的生存状况：可以看到生存死亡人数越多，对应a图中的风险评分就更高。
5c：展示了低风险和高风险组中五个预后基因表达谱的热图：发现高风险组的基因表达情况：PADI1高表达，而ATP6V0D2，DPP6，C9orf135和PLG低表达。
5d：根据风险评分高低分组绘制的KM生存曲线：与低风险评分组相比，高风险评分组的OS较差。
5e：tROC曲线：使用R软件包“ survivalROC”绘制tROC曲线。（跟补充文件7中的S4比较），将5个基因联合起来一起判断预后在1，3，5年中的AUC值比单基因的更大，模型预测的精确程度更高。
图5：训练集中的5-基因预后模型的分析
6：作者对AJCC分期，等级，性别，年龄，偏侧性和复发患者进行了风险分层，并进行了KM生存分析。
图6：不同分组的5-基因风险评分模型的KM生存分析曲线
5. 5-基因预后模型的内部验证和外部验证
作者使用测试集（n = 151）的样本和从TCGA下载的全部样本（n = 504），加上 GSE29609 的数据（n = 39）进行验证。使用上述的5-基因的系数进行风险评分的计算，按照中位数分组。在ccRCC的患者中，这个5基因预后的模型在预测患者的OS表现很好。
7a-c：分别对应内部验证，全集，外部验证的KM生存曲线，提示跟在训练集中的结论一样，高风险组的预后比低风险组的预后更差。
7d-f：分别对应内部验证，全集，外部验证的时间依赖的ROC曲线。
图7：5-基因预后模型的验证。
6. 基于基因的诺模图模型的建立和验证
作者通过单变量和多变量Cox比例风险回归分析筛选了所有的独立预后参数，构建了复合诺模图。通过tROC曲线对其预测效率进行了验证。
8a：ccRCC中单变量Cox回归分析的森林图。8b：ccRCC中多元Cox回归分析的森林图。发现包含其他临床参数（如AJCC分期，年龄和复发状况）的5-基因预后模型可能是训练集中影响OS的独立预后变量。
8c：整合了基于5-基因的风险评分，AJCC分期，年龄和复发率的诺模图 。以预测ccRCC患者的1，3，5年OS。
图8：确定独立的预后参数并建立基于基因的预后模型
9a：在训练集中使用诺模图模型，预测结果显示与实际结果有良好的一致性。
9b-d：对训练集的测试，展示了诺模图模型，5-基因预后风险评分模型，AJCC分期的tROC曲线。结论表明基于基因的诺模图模型可能是预测OS的最佳手段。
9e,i：使用内部验证集和总集来测试基于基因的诺模图模型的预测值。
9f-h,j-l：表明无论在哪一组中，基于基因的诺模图模型都比AJCC分期以及5-基因风险评分模型具有更好的预测效果。
图9：基于基因的诺模图在预测生存概率中的表现，以及与5-基因风险评分模型、AJCC分期的预测能力的比较
7. 鉴定DEGs和5个预后基因的生物学通路
作者使用GO和KEGG富集分析来鉴别399个DEGs。条形的颜色越深，表示有更多的基因在此富集。
10a：GO生物学分析表明，DEGs富含单价无机阳离子跨膜转运蛋白活性，基底外侧质膜，膜的锚定成分以及细胞对生长因子刺激的反应等。
10b：在KEGG通路分析中，确定了DEGs的PPAR信号通路，黑素瘤，细胞粘附分子（CAM）和其他生物通路。
图10：399个DEGs的功能富集分析
11：进行了GSEA分析，鉴定5个预后有关基因的潜在生物学过程。结果表明：
ATP6V0D2，DPP6和PADI1过表达的样本分别富集溶酶体，黏附连接和糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素。
C9orf135和PLG低表达的样本分别富集PPAR信号通路和p53信号通路。
图11：与5个预后基因表达有关的GSEA分析
小结
在研究中，作者从可公开获得的数据中确定了五种新的预后DEGs，并使用生物信息学方法构建了基于这5个基因的预后诺模图模型，其中包含其他的临床预后参数，以预测ccRCC患者1年，3年和5年OS。其预测能力优于传统的AJCC分期。这五个基因可能是ccRCC中潜在的生物标志物，基于基因的诺模图模型可能会在临床实践中用于预测个体存活率并促进ccRCC患者个体治疗方案的选择。