差异分析

基因的差异表达，即发现一组在正常样本和患病样本中表达不同的基因。

差异基因的筛选方法

1、倍数变化（fold change）

最简单的是阈值法，用倍数分析基因表达水平差异，即计算基因在两个条件下表达水平的比值（癌症和正常），确定比值的阈值，将绝对值大于此阈值的基因判断为差异基因。

• 差异基因的上调和下调

  • 我们一般使用 log2 （fold change）。当expr(A) < expr(B)时，B对A的fold change就大于1，log2 fold change就大于0（见下图），B相对A就是上调；

  • 当expr(A) > expr(B)时，B对A的fold change就小于1，log2 fold change就小于0;

  • 通常为了防止取log2时产生NA，我们会给表达值加1（或者一个极小的数），也就是log2(B+1) - log2(A+1).

  

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通常选择2~3倍作为阈值，但对于低表达的基因，3倍也是噪音，那些高表达的基因，1.1倍都是生物学显著了。更重要的没有考虑到组内变异，没有统计学意义。

2、统计检验

最常用的T-test、ANOVA(方差分析)或者称为F检验。

对于基因芯片的数据而言，由于样本服从正态分布，所以可以用t-test（双处理）或anova分析（多处理以上）。

二代测序RNA-Seq它的抽样过程是离散的，结果是count，服从泊松分布，样本间的差异是服从负二向分布.

• 方差分析（ANOVA)和线性回归分析(regression)都是同一时期发展的两套紧密相连的理论。方差分析考量的是离散型自变量(因子）对连续型应变量（响应变量）的模型分析，而线性回归分析只要求响应变量是连续的，对于自变量无要求。如果响应变量不是连续型分布，就要使用更加一般化的广义线性模型（generalized linear model),通过一个连接函数变换响应变量期望，将响应变量的期望与自变量建立线性关系。

T-test 检验是差异基因表达检测中常用的统计方法，通过合并样本间可变的数据，来评价差异表达，用于判断某一基因在两个样本中是否有差异表达。由于芯片实验成本较高，样本量较少，从而对总体方差的估计不很准确，T检验的检验效能降低。

3、SAM算法

SAM算法就是通过控制FDR值纠正多重假设检验中的假阳性率。SAM 方法检验差异表达，通过对分母增加一个常量 T 检验过程减小了假阳性发生的概率。根据文献记载，相比较其他算法，SAM算法更为稳定，筛选出的结果也更为准确。SAM方法以q-value< 0.05作为筛选差异表达基因的标准，从公式上来看，p-value和q-value较为相似，而差异筛选是一个典型的多重假设检验过程。对于多重假设检验，单次检验中差异显著基因的假阳性率(p-value较小)可能会较大，而q-value 和 FDR值较常见的BH校正方法得到的FDR值而言，改进了其对假阳性估计的保守性。

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火山图

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火山图可反映总体基因的表达情况，横坐标代表log2（Fold Change）,纵坐标表示-log10（P值），每个点代表一个基因，颜色用以区分基因是否差异表达，图中橙色的点代表差异表达基因，蓝色的点代表没有差异表达的基因。

聚类图

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聚类图可以衡量样本或基因之间表达的相似性。 如上图所示的聚类图中，横坐标代表样本聚类，一列代表一个样本，聚类基于样本间基因表达的相似性，样本间基因表达越接近，靠的越近，以此类推。 纵坐标代表基因聚类，一行代表一个基因，聚类基于基因在样本中表达的相似性，基因在样本中表达越接近，靠的越近，以此类推。 色阶代表基因表达丰度，越红代表上调得越明显，越绿代表下调得越明显。

REF：
https://www.jianshu.com/p/b55276e46f0c

https://blog.csdn.net/u012325865/article/details/87344725

http://college.gcbi.com.cn/archives/1616

https://www.cnblogs.com/leezx/p/7132099.html