物种内共线性分析——思路以及踩坑总结（二）

物种内共线性分析(MCScanX+BLAST+TBtools)

数据要求：做物种内共线性分析的话主要需要的是
全基因组序列、cds或pep序列、gff3/gtf序列三者缺一不可。
上一节下载好了cds序列以及gff3序列文件，以此为例(数据可在Phyzome下载，也可以在服务器上在线下载)

2021.10.15更：因为这些内容之前都是通过Markdown写的，转过来可能现在代码块变得极其难看，我的个人博客网址是：lxz9.com 以及 公众号：生信技术，大家可以关注一下，以后我会更新优质、准确、详细的内容教程，下面是原内容

软件要求：MCScanX、blast、TBtools(JCVI)

物种内blast

物种内blast 使用cds或pep序列进行自我比对，结果*.blast格式得到此结果(这一步耗时最长，可以使用TBtools一键完成，有服务器的同学可以使用服务器运行)

blast构建索引 | makeblastdb

makeblastdb -in Zmarina_324_v2.2.cds.fa -dbtype nucl -out Zmarina.db

参数说明：

-in 后接输入文件，你要格式化的fasta序列
-dbtype 后接序列类型，nucl为核酸，prot为蛋白
-out 后接数据库名，自定义，后续blast+要用到的-db的参数
-logfile 日志文件，如果没有默认输出到屏幕

比对核酸数据库(blastn)

如果下载的cds序列

blastn  -query Zmarina_324_v2.2.cds.fa -db Zmarina.db -out Zmarina.blast -evalue 1e-10 -num_threads 10 -outfmt 6 -num_alignments 5

比对蛋白数据库(blastp)

如果下载为pep序列

blastp  -query Zmarina_324_v2.2.pep.fa -db Zmarina.db -out Zmarina.blast -evalue 1e-10 -num_threads 10 -outfmt 6 -num_alignments 5

参数说明：

-query： 输入文件路径及文件名
-out：输出文件路径及文件名
-db：格式化了的数据库路径及数据库名
-outfmt：输出文件格式，总共有12种格式，6是tabular格式对应BLAST的m8格式
-evalue：设置输出结果的e-value值
-num_threads：线程数
-num_alignments: 设置每个query保留多少条匹配结果

gff序列简化

已知gff序列分成许多行，其实我们只需要四行，所以需要将这四行提取出来得到简化后的gff文件
简化的步骤可用脚本获得如下：

##Phytozome GFF3文件处理
awk -F '[\t;]' '{if($3=="mRNA")print $1"\t"$10"\t"$4"\t"$5}' Zmarina_324_v2.2.gene.gff3 | sed 's/Name=//g' > Zmarina_324_v2.2.gene.gff3.gff
##CDS序列文件处理
cut -d " " -f 1 Zmarina_324_v2.2.cds.fa > Zmarina_324_v2.2.cds.simple.fa、
##提取第一列染色体(control文件，设置需要展示的染色体信息(和gff的第一列一致))
awk '{print $1}' ./CH_word_ls.txt > ./out.txt
##删除文件 text中第一列
#方式一 
awk '{$1="";print $0}' text
#方式二
sed -e 's/[^ ]* //' text

MCScanX

命令行格式：MCScanX + 名称(这里需要注意的是前面得到的简化后的gff文件以及blast之后的结果文件；命名须一致)
比如得到的blast结果为zm.blast,简化为四列后的gff文件为zm.gff
使用命令MCScanX zm即可得出共线性结果。

$ ls -lh
总用量 6.5M
-rw-r--r--. 1 lixingze lixingze 5.6M 12月 17 00:55 zm.blast
-rw-r--r--. 1 lixingze lixingze 4.1K 12月 17 00:55 zm.collinearity
-rw-r--r--. 1 lixingze lixingze 845K 12月 17 00:55 zm.gff
drwxr-x---. 2 lixingze lixingze  28K 12月 17 00:55 zm.html
-rw-r--r--. 1 lixingze lixingze  20K 12月 17 00:55 zm.tandem

运行此软件即可得出结果文件：
名称.html,
名称.collinearity, (包含了共线性分析的结果)
名称.tandem(串联重复)

在这一步遇到了问题是一直出不来结果的原因：
上面gff格式的问题tab改为空格等原因导致软件跑不出来共线性。可以通过文本软件检查一下格式是否准确

可视化circos

在这里可以用的有TBtools、circos、JCVI等软件进行可视化其中需要配置很多的文件进行分析出图
准备好简化后的四列gff文件；*.blast文件
以及MCScanX分析得出的.collinearity和.tandem进一步分析步骤
这里以TBtools为例进行说明：
整体流程如下～

1. 用到 Advanced Circos 模块

需要准备的文件如下：

• 染色体长度文件：
  用到 fasta stat 模块， 将基因组的文件输入进去，输出整个染色体长度的文件；提取染色体的长度信息，保存为文本文件，ChrLen.txt ( Advanced Circos 模块 需要的文件1)

• 基因组内的共线性：
  将共线性分析结果，转换成GenePairTable(模块Text Merge for MCScanX;输入前面得到的.collinearity文件，Merge Mode选择Collinear输出txt文件命名为GenePair.tab.txt),之后需要继续转换为LinkedRegion文件(模块Text Transformat for Micro-Synteny View;Input File Format为GenePair，输出命名为LickedRegion.tab.txt)

这一步做完就得到了他们的共线性关系
需要的是展示WRKY基因家族内部参与的复制事件，所以与WRKY·ID相关的连接线应该被高亮出来。或者我们直接补充一些高亮的线进去就可以了
直接使用TBtools的文本区块提取工具【Text Block Extract】

结果图

参考

关于TBtools这一部分内容可以参考此处更为详细