2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍

摘要

本次笔记是基迪奥单细胞课程第二章，根据课件以及上课老师的情况来看，比之前的美格和菲沙都要好一些，而且价格更优惠。从官网也可以看到基迪奥在培训这方面是作为重点业务。等上完剩余课程，我会进行一个简单的小结，来评估几个公司之间的课程质量。
之前公司生信团队已经对单细胞分析有部分研究讨论，本次课程可以对大家进行一个查缺补漏，内容也更加全面和体系化，因此还是比较推荐。

课程目录

流程分析软件

软件	期刊	运行环境
CellRanger	-	-
Seurat	Nature Biotechnology	R
Scanpy	Genomic Biology	python
scVI	Nature Methods	python
Bioconductor	Nature Methods	R
……

基础分析流程

数据质控

测序统计

统计测序饱和度、捕获细胞数、平均数据量、平均检测基因数。
使用官方软件：Cell Ranger

细胞过滤

1）高RNA量细胞捕获
UMI总量最高的前N（预期细胞数）个细胞RNA总表达丰度的
99%分位数的1/10，作为有效细胞的最低阈值

2）低RNA量细胞捕获
确定空载的GEM的丰度基线，然后找出与空载的GEM存在显著差异
的GEM。这个步骤可能可以额外找到低RNA丰度的细胞。

表达定量

Read1 提 取 16bp GemCode Barcode 和12bp UMI，
Read2 提 取 cDNA插入片段
利用GemCode序列来区分细胞
利用UMI来区分不同原始转录本：利 用Read2 比对基因，
利用Read1 的UMI进行定量

聚类分群

数据合并

同时分析多个样本时，需要将各个样本合并为一套数据，便于
后期进行样本间的比较。

批次效应

批次效应（Batch effect）通常指的是实验指标检测中，来源关注的生物学处理效应之外的其他因素导致的样本结果的波动。
比如所检测的样本来源不同的实验环境、不同检测技术、试剂批次变化、不同实验员手法的差异，都会额外引入差异。
批次效应理论上在任何实验中都可能存在。高通量测序由于检测精度高，因此对批次效应更加敏感。

批次效应带来的基因表达变化，对任何定量研究都有影响。

• 10x单细胞研究的额外影响：导致本该聚类在一起的细胞因为批次效应被分为不同的簇，影响了细胞亚群鉴定的准确性，以及下游的所有分析。

实验解决方法：

1. 有条件，就尽可能一次收集所有样本，一次做完（但实际情况往往不允许）
   2）采用速冻法保存样本，等收集足够以后，用提核法一次完成文库制备（样本难收集，周期长的项目，可以考虑这种方法）。
   生信解决方法：

MNN矫正

CCA矫正

实操矫正代码

#####代码例子：
## We then identify anchors using the FindIntegrationAnchors function,
which takes a list of Seurat objects as input, and use these anchors to integrate 
the two datasets together with IntegrateData.
#（1）# 建立MNN关系对
immune.anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = 
ifnb.list, anchor.features = features)
# （2）对表达量进行矫正
immune.combined <- IntegrateData(anchorset = immune.anchors)
#（3）后续的聚类分群、差异分析等与正常流程类似

harmony矫正

首先，Harmony应用主成分分析，将转录组表达谱嵌入到低维空间中，然后应用迭代过程去除数据集特有的影响。
（A）Harmony概率性地将细胞分配给cluster，从而使每个cluster内数据
集的多样性最大化。
（B）Harmony计算每个cluster的所有数据集的全局中心，以及特定数据
集的中心。
（C）在每个cluster中，Harmony基于中心为每个数据集计算校正因子。
（D）最后，Harmony使用基于C的特定于细胞的因子校正每个细胞。由
于Harmony使用软聚类，因此可以通过多个因子的线性组合对其A中进行
的软聚类分配进行线性校正，来修正每个单细胞。
重复步骤A到D，直到收敛为止。聚类分配和数据集之间的依赖性随着每一
轮的减少而减小。

harmony算法优势

1. 整合数据的同时对稀有细胞的敏感性依然很好；
2. 省内存，运行速度快，适用于大样本；
3. 适合于更复杂的单细胞分析实验设计，可以比较来自不同供体，组织和技术平台的细胞。

细胞过滤

细胞过滤是在开始正式分析前，进一步过滤得到可信的细胞用于
后续分析。

人为设定的一些经验标准，例如：
单细胞中鉴定到的gene数量
单细胞中UMI的总数。UMI总数过高则可能是由于实验过程中两个细胞进入了一个微滴，这类数据需要去除。
单细胞中UMI的线粒体基因表达量比例（小于10%，数值不固定）

亚群聚类

算法步骤：
（1）表达量均一化：A = log( 1 + ( UMIA ÷ UMITotal ) × 10000 )
其中，A：目标细胞中目标基因A的表达量；UMIA: 目标细胞中A基因的UMI数量；UMITotal：目标细胞中所有UMI数量的总和；log：以e为底数的自然对数。本质上就是消除不同细胞数据量的不同（因此，cell ranger的深度均一化是非必须的）。
（2）PCA分析，挑选主成分（降维），涉及：高可变基因筛选；
（3）聚类分群，涉及：分群标准的确定；

高变基因筛选与PCA分析

筛选方差较高的可变基因（例如top 2000）
PCA分析，并挑选显著（P<0.01）的主成分（PC），用于下一步的分析（降维）
本质：下一步用主成分进行亚群划分。因此主成分可以降低细胞间噪音信号的干扰。

聚类

Seurat软件使用基于图论的聚类算法对细胞进行聚类和分群。主要
包括以下步骤：
（1）构建细胞间的聚类关系：利用显著的主成分构建基于欧式距离的
KNN聚类关系图；
（2）优化细胞间聚类关系距离的权重值：利用Jaccard相似性优化细胞间
距离的权重值；
（3）聚类和分群：使用Louvain 算法进行细胞群聚类优化。

可视化

在群体单细胞领域，tSNE是更适合PCA的算法

1. 在这里t-SNE（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) 只是用于将细胞排在一个二维空间里（散点图） 。然后将每个点根据亚群来源（上一步分析得到的），涂上不同的颜色。
2. 为什么用tSNE？
   答： tSNE是非线性的方法。简单理解就是：相似的细胞保持紧密聚类的同时，差异越大的细胞，在图中的距离越被夸大。这样不同亚群的细胞，群间的隔离更彻底，更清晰。还有类似的算法UMAP。
3. 为什么图中相同颜色相同的细胞（属于一类）好像来源不同的簇？
   答：因为分类定义来自上一页的步骤，而这里t-SNE聚类是另一种方法。不同方法，最后呈现出的细胞的相似性并不相同。

亚群鉴定(关键，耗时最久)

10X 单细胞转录组数据解读中，最耗费精力也是最关键的一部分是亚群的定义。

可以参考的鉴定步骤：
（1）从已有研究基础，样本特性等预估样本中潜在有哪些细胞亚群；
（2）搜寻对应细胞亚群的已知基因标记；
（3）基于已知基因标记进行亚群分类识别；
（4）对于依然无法定义的细胞亚群，也可以直接从亚群上调表达的基因去推测其潜在类型。或者，可以考虑，从其他其他物种/组织文献的相关报道中推测

标记基因

标记基因：又称marker基因，就是每个亚群特征或上调表达的基因（默认是和其他所有亚群比较）
一般来源文献或数据库

数据库	物种	细胞类型	数据信息
Mouse cell Atlas	小鼠	所有	基因 细胞亚群
Cell Marker	人、小鼠	所有	基因 细胞类型 文献出处
Cancer SEA	人	癌细胞	基因 癌症类型 功能解析
PanglaoDB	人、小鼠	所有	基因 细胞类型 统计学分析
haemosphere	人、小鼠	体液细胞	基因 细胞类型 表达量数

亚群定义

综合考虑各种逻辑，定义有争议的亚群（可以被定义到两类细胞的亚群）。
例如，本次范例红细胞相关的4个亚群，根据标记分群存在重叠。
(a) 满足IE2标记（表达的基因与不表达基因）要求的亚群只有C3，则先确定C3属于IE2；
(b) IE1只能选择C5；
© IE3（2，4）与ME（0，2，8）存在C2的重叠。无论从基因表达量还是聚类图中的距离，都很难判定，C2应该属于IE3还是ME，可能需要更多标记来判定。考虑到C2主要存在pre样本，暂时把他定义为成熟的细胞，所以分类为：
IE3：C4
ME：C0,C2,C8

特征分析

频率统计

细胞亚群频率（占总体百分比）的变化，也是常见的讨论内容。
这也是 10X genomics 设置生物学重复的主要意义之一。

亚群特征表达基因

亚群特征基因的展示，经常使用小提琴图和映射图方式。

个性数据挖掘

瞬时状态

每个细胞都有独立的分子特征，了解细胞“此时此刻”所具有的特征是异质性研究的基础。
细胞功能（GSEA、GSVA）
拷贝数变异（CNV）

细胞演化

拟时分析
RNA速率分析
细胞周期分析

细胞关联

WGCNA分析
转录因子分析
细胞通讯分析

小结

关于标记基因
（1）特异标记基因，不等于特有表达。在其他类型的组织中也存在表达，只是相对丰度更低。甚至在其他细胞类型中，也存在较高表达。
（2）某个群体里的标记基因，并不意味着这个群体每个细胞都表达，而是平均表达量和表达所占的细胞比重较高。

有可能10X的结果与之前文献的报道不完全一致（文献解析中也会再次提及）。可能原因包括：由于样本状态（药物处理）、特定的组织时期、个体差异、检测技术不同等因素。

对单细胞有研究的小伙伴可以加微信bbplayer2021，进入交流群，一起交流研究。