WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结

目录

一. WGCNA 安装及介绍

1.1 安装及出现问题的解决方案

1.2 WGCNA 概念

二. WGCNA 实例及总结

2.1 导入表达谱数据 + 样品性状数据

2.2 数据预处理

2.3 筛选合适的阈值

2.4 分割模块，作网络图

2.5 关联模块与表型，作相关系数图

2.6 根据模块间的相似性及向异性，作树杈图

2.7 查看特定模块中的特定基因与特定形状关系

2.8 最后导出模块中 TOM值 的数据，导入 cytoscape 作图

2.9 用 cytoscape 将上述特定模块中的基因以互作网络图形式展现，以一定的标准来选择 hub gene 作为后续研究的重点

---

一. WGCNA 安装及介绍

1.1 安装及出现问题的解决方案

• WGCNA 官网安装地址（国外）：https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/

• ---

  WGCNA 安装前提：需要安装 R 和 Rstudio 

• ---

  WGCNA 安装命令（在 Rstudio 中输入命令，从 CRAN 自动安装，比手动方便）：
• install.packages（“ BiocManager”）
  BiocManager :: install（“ WGCNA”）

• ---

  出现报错的解决方案：
• 查过手动安装未加载的包，失败，手动易出现更多问题

• ---

  最终成功的方案：重复执行 CRAN 安装方法的命令

1.2 WGCNA 概念

• 参考文档：https://mp.weixin.qq.com/s/n2DDYAvnnDO5Gw8QsrXCXQ?

• ---

  WGCNA 分析：加权基因 共表达网络分析
• 该分析方法旨在：

1. 寻找协同表达的基因模块(module)
2. 探索基因网络与关注的表型之间的关联关系，以及网络中的核心基因

• 应用场景及研究方向：不同器官或组织类型发育调控、同一组织不同发育调控、非生物胁迫不同时间点应答、病原菌侵染后不同时间点应答

• ---

  基本思路：

1. 在大样本（推荐5组 / 15个样品以上）基因表达数据中，找出具有 相似表达谱 的基因，归于同一模块（module）
2. 对模块进行区分，通过：模块特征值（module eigengene）/  枢纽基因（hub gene）
3. 计算 模块与模块相关性、模块与样本性状相关性
4. 筛选 与性状高度相关 的模块，分析此模块内部的基因，找到所需的目标基因

• ---

  同类方法比较：
• 与普通聚类方法的不同：将基因表达值的相关系数取了 n次幂，使相关系数分布更加合理
• 与其他共表达网络分析的不同：加入了软阈值、权重网络的概念

• ---

  WGCNA 分析（属于预测范畴）步骤：

1. 数据输入和数据清洗
2. 建设表达网络和模块检测
3. 筛选与表型相关的模块
4. 使用 WGCNA 进行网络可视化

• ---

  WGCNA 分析（属于预测范畴）步骤（详细版）：

1. 计算任意基因之间的相关系数 —— 为了衡量两个基因是否具有相似表达模式，需要设置 阈值 筛选
2. 高于阈值就是相似的，但如果将阈值设为 0.8，就很难说明 0.8 和 0.79 两个是有显著差别的
3. WGCNA分析时采用：相关系数加权值（对基因相关系数取N次幂），使得网络中的基因之间的连接服从 无尺度网络分布 (scale-freenetworks)，这种算法更具生物学意义
4. 基于基因相关系数，构建分层聚类树，聚类树的不同分支、不同颜色代表不同的基因模块
5. 基于基因的加权相关系数，将基因按照表达模式进行分类，将模式相似的基因归为一个模块
6. 几万个基因通过基因表达模式，被分成了几十个模块，是一个 提取归纳信息 的过程
7. 得到模块之后的分析： 模块的功能富集、模块与性状的 相关性、模块与样本的 相关系数 
8. 挖掘模块的关键信息：找到模块的核心基因、利用关系预测基因功能

二. WGCNA 实例及总结

• 此节包含了 —— 表达谱文件 + 样本性状文件，总结了 WGCNA 使用流程

2.1 导入表达谱数据 + 样品性状数据

• Mine：
• 表格内容：每个基因在不同组织当中的表达值
• 表头是样本信息（比如花生哪个组织采样，叶子、花等等），第一列是花生基因ID
• 

• ---

  Example：
• 表达谱矩阵可看出：有 3600个基因、136个样本；
• 样品性状矩阵可看出：有 361个样本、7个性状；

————————————————————————————————————————————————————————————————————
Mine：
————————————————————————————————————————————————————————————————————
// 加载 WGCNA软件
library(WGCNA)
options(stringsAsFactors = FALSE)

// 允许R语言程序最大线程运行
allowWGCNAThreads()

// 调换文件打开根目录
> setwd("D:/Desktop/Desktop/大创") 

// 检查当前根目录
> getwd() 
[1] "D:/Desktop/Desktop"

// 读取 txt 数据文件，并赋值给 dataExpr变量
> dataExpr <- read.table('FPKM_qu0_name1_qulie.txt',sep = '\t',header = TRUE)

// dim()：查看变量维数
> dim(dataExpr)

// 52688 个基因，55个样本
[1] 52688    55
————————————————————————————————————————————————————————————————————
Example：
————————————————————————————————————————————————————————————————————
dataExpr <- read.csv(file = "Sample_Expr.csv") // 表达谱文件
dim(dataExpr) // 表达谱矩阵
[1] 3600  136

dataTraits <- read.csv(file = "ClinicalTraits.csv") // 样本性状文件
dim(dataTraits) // 样品性状矩阵
[1] 361   7

---

2.2 数据预处理

• 通过过滤低表达量、低变异系数的基因，以减少参与后续分析的基因数目，提高结果可靠性
• 由于实验数据的特殊性，就不做前一步处理了
• 将矩阵写为符合 WGCNA 要求的形式：行名为 gene，列名为样品
• 让性状数据和表达谱数据保持一致（一一对应）

// as.data.frame()：将已存在的数据转为数据框格式；
// t()：将行列数据转置
dataExpr <- as.data.frame(t(dataExpr))

// colnames()：修改矩阵的列名
colnames(dataExpr) <- dataExpr[1,]
dataExpr <- dataExpr[-1,]

// unlist()：将list结构的数据,变成非list的数据
// as.numeric:转为数字格式
dataExpr <- unlist(apply(dataExpr, 1, as.numeric))

// $Mice：缺失值填补
// match(x,y)：返回一个和 x 长度相同，同时和 y 中元素相等的向量
match_trait <- match(rownames(dataExpr), dataTraits$Mice)
rownames(dataTraits) <- dataTraits$Mice

// c(): 将括号中的元素连接起来，不创建向量，c(1, 2:4)，结果为 1 2 3 4
// paste(): 连接括号中的元素，创建向量，paste(1, 2:4)，结果为 “1 2” “1 3” “1 4”
Traits <- dataTraits[match_trait, -c(1,2)]

---

2.3 筛选合适的阈值

• Mine：
• 选一个合适的值，使样本变为一个无尺度分布：
• 
• 少部分基因处于绝对优势的位置（表达量高），大部分处于劣势（表达量低）
• 对基因间的相关系数取幂指数，最终确定合适的阈值

// 选择一组阈值 把 1-20 写成数组赋值给 powers
// seq()：seq(2,10,2),会生成一组数:2 4 6 8 10
powers <- c(c(1:10), seq(from = 12, to=20, by=2))
sft <- pickSoftThreshold(dataExpr, powerVector = powers)

// 绘制结果图
par(mfrow = c(1, 2))
plot(sft$fitIndices[, 1], 
     -sign(sft$fitIndices[, 3]) * sft$fitIndices[, 2],
     xlab = "Soft Threshold (power)", 
     ylab = "SFT, signed R^2", type = "n", 
     main = paste("Scale independence"))
text(sft$fitIndices[, 1], 
     -sign(sft$fitIndices[, 3]) * sft$fitIndices[, 2],
     labels = powers, col = "red")
abline(h = 0.9, col = "red")
plot(sft$fitIndices[, 1], 
     sft$fitIndices[, 5], 
     type = "n", 
     xlab = "Soft Threshold (power)",
     ylab = "Mean Connectivity", 
     main = paste("Mean connectivity"))
text(sft$fitIndices[, 1], 
     sft$fitIndices[, 5], 
     labels = powers, col = "red")

• ---

  
• 根据上图中的红线位置，确定 power 阈值选为7，R²  = 0.9
• WGCNA 建议的阈值，输入sft 查看，列表第一项就是估计的最优值
• 

• ---

  Mine:
• 

---

2.4 分割模块，作网络图

• 分割模块：
• 采用动态剪切树算法（dynamic tree cutting），分为两种：

1. 一步法：简单明了，一步出结果
2. 分步法：细调参数，以达到满意结果

• 官网没说哪种适合什么条件，都可以用，参考如下：
• http://blog.sina.com.cn/s/blog_61f013b80101lcpr.html

net <- blockwiseModules(dataExpr, power = 7, maxBlockSize = 5000,
               TOMType = "unsigned", minModuleSize = 30,
               reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
               numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
               saveTOMs = TRUE,
               saveTOMFileBase = "FPKM-TOM",
               verbose = 3)
moduleLabelsAutomatic <- net$colors
moduleColorsAutomatic <- labels2colors(moduleLabelsAutomatic)
# A data frame with module eigengenes can be obtained as follows
MEsAutomatic <- net$MEs

• ---

  展示网络图：

plotDendroAndColors(net$dendrograms[[1]], moduleColorsAutomatic[net$blockGenes[[1]]],
            "Module colors",
            dendroLabels = FALSE, hang = 0.03,
            addGuide = TRUE, guideHang = 0.05)

• ---

  Example wgcna_module：
• 
• Mine:
• 

---

2.5 关联模块与表型，作相关系数图

• 结合模块与样本性状的相关性来分析，将模块与表型关联：

nGenes <- ncol(dataExpr)
nSamples <- nrow(dataExpr)
#same to MEsAutomatic
MEs0 <- moduleEigengenes(dataExpr, moduleLabelsAutomatic)$eigengenes
#ME(module eigengene)
MEs <- orderMEs(MEs0)
modTraitCor <- cor(MEs, Traits, use = "p")
modTraitP <- corPvalueStudent(modTraitCor, nSamples)

• 然后做模块与表型相关系数图：

textMatrix <- paste(signif(modTraitCor, 2), "\n(", signif(modTraitP, 1), ")",sep = "")
dim(textMatrix) <- dim(modTraitCor)
par(mar = c(6, 5.5, 3, 3))
labeledHeatmap(
    Matrix = modTraitCor, xLabels = names(Traits), yLabels = names(MEs),
    ySymbols = names(MEs), colorLabels = FALSE, colors = greenWhiteRed(50),
    textMatrix = textMatrix, setStdMargins = FALSE, 
    cex.text = 0.7, zlim = c(-1, 1), main = paste("Module-trait relationships")
)

• 
• 图中，y轴是模块名，x轴是性状，每个模块都跟每个性状有一个空格，空格的上部分是模块与性状的相关系数，空格的下部分是一个p值，代表相关系数的显著性

• ---

  其实随着 WGCNA 的广泛使用，其用处不仅局限于对性状的分析，还可以结合模块与样本的相关性来分析
• 比如当研究不同处理组织或者不同发育时期的植物时，如果想了解处理或者不同时期中那些模块对其有显著影响，那么我们可以自行构建类似于性状的 Traits 矩阵
• 最简单的一种方法就是：默认为各个样本间是无关联的，那么Traits 矩阵则为标量矩阵，当然还有其他方式（比如考虑样品有生物学重复的情况）

---

2.6 根据模块间的相似性及向异性，作树杈图

• 查看每个模块之间的相似性以及向异性，并作树杈图

dissimME <- (1-t(cor(MEs, method="p")))/2
hclustdatME <- hclust(as.dist(dissimME), method="average" )
# Plot the eigengene dendrogram
plot(hclustdatME, main="Clustering tree based of the module eigengenes")

• wgcna_hclust：
• 

2.7 查看特定模块中的特定基因与特定形状关系

• 查看特定模块中的基因对于特定性状是否具有高GS值（gene significance）和MM值（module membership）
• 以 weigth 为例：

1. 需要先计算每个基因在每个模块中的KME值
2. 然后再计算GS值
3. 最后作图

MEs0 <- moduleEigengenes(dataExpr, moduleColorsAutomatic)$eigengenes
weight <- as.data.frame(Traits$weight_g)
names(weight) = "weight"
GS.weight = as.numeric(cor(dataExpr, weight, use = "p"))
MEs <- orderMEs(MEs0)
datKME <- signedKME(dataExpr, MEs)
ME2Column <- substring(names(MEs), 0)
column <- match("MEblack", ME2Column)
restModule = moduleColorsAutomatic == "black"
verboseScatterplot(MEs[restModule, column], GS.weight[restModule],
                   xlab = paste("Module Membership ","black", "module"),
                   ylab = "GS.weight", main = paste("kME.", "black", "vs. GS"), col = "black")

• wgcna_GC_MM：
• 

---

2.8 最后导出模块中 TOM值 的数据，导入 cytoscape 作图

• 最后导出模块中TOM值的数据，导入 cytoscape 作图：

TOM <- TOMsimilarityFromExpr(dataExpr, power = 7)
# Select modules需要修改，选择需要导出的模块颜色
modules <- c("black")
# Select module probes
probes <- colnames(dataExpr)
inModule <- is.finite(match(moduleColorsAutomatic, modules))
modProbes <- probes[inModule]
# Select the corresponding Topological Overlap
modTOM <- TOM[inModule, inModule]
dimnames(modTOM) <- list(modProbes, modProbes)
# Export the network into edge and node list files Cytoscape can read
cytoscape <- exportNetworkToCytoscape(modTOM,
                               edgeFile = paste("FPKM-One-step-CytoscapeInput-edges-", paste(modules, collapse="-"), ".txt", sep=""),
                               nodeFile = paste("FPKM-One-step-CytoscapeInput-nodes-", paste(modules, collapse="-"), ".txt", sep=""),
                               weighted = TRUE,
                               threshold = 0.2,
                               nodeNames = modProbes,
                               nodeAttr = moduleColors[inModule])

• 并做一个TOM图，如下：

dissTOM <- 1 - TOM
plotTOM = dissTOM^7
diag(plotTOM) <- NA
geneTree <- net$dendrograms[[1]]
TOMplot(plotTOM, geneTree, moduleColorsAutomatic, main = "Network heatmap plot, all genes")

• wgcna_TOM：

• 

---

2.9 用 cytoscape 将上述特定模块中的基因以互作网络图形式展现，以一定的标准来选择 hub gene 作为后续研究的重点

• 也可以对模块中的每个基因进行注释，做GO以及KEGG富集
• 根据富集到的通路，结合模块信息来确定哪个模块的基因作为后续研究的重点