WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结

目录

一. WGCNA 安装及介绍

1.1 安装及出现问题的解决方案

1.2 WGCNA 概念

二. WGCNA 实例及总结

2.1 导入表达谱数据 + 样品性状数据

2.2 数据预处理

2.3 筛选合适的阈值

2.4 分割模块,作网络图

2.5 关联模块与表型,作相关系数图

2.6 根据模块间的相似性及向异性,作树杈图

2.7 查看特定模块中的特定基因与特定形状关系

2.8 最后导出模块中 TOM值 的数据,导入 cytoscape 作图

2.9 用 cytoscape 将上述特定模块中的基因以互作网络图形式展现,以一定的标准来选择 hub gene 作为后续研究的重点


一. WGCNA 安装及介绍

1.1 安装及出现问题的解决方案

  • WGCNA 官网安装地址(国外):https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/

  • WGCNA 安装前提:需要安装 R 和 Rstudio 

  • WGCNA 安装命令(在 Rstudio 中输入命令,从 CRAN 自动安装,比手动方便):
  • install.packages(“ BiocManager”)
    BiocManager :: install(“ WGCNA”)

  • 出现报错的解决方案:
  • 查过手动安装未加载的包,失败,手动易出现更多问题

  • 最终成功的方案:重复执行 CRAN 安装方法的命令

1.2 WGCNA 概念

  • 参考文档:https://mp.weixin.qq.com/s/n2DDYAvnnDO5Gw8QsrXCXQ?

  • WGCNA 分析:加权基因 共表达网络分析
  • 该分析方法旨在:
  1. 寻找协同表达的基因模块(module)
  2. 探索基因网络与关注的表型之间的关联关系,以及网络中的核心基因
  • 应用场景及研究方向:不同器官或组织类型发育调控、同一组织不同发育调控、非生物胁迫不同时间点应答、病原菌侵染后不同时间点应答

  • 基本思路:
  1. 在大样本(推荐5组 / 15个样品以上)基因表达数据中,找出具有 相似表达谱 的基因,归于同一模块(module)
  2. 对模块进行区分,通过:模块特征值(module eigengene)/  枢纽基因(hub gene)
  3. 计算 模块与模块相关性、模块与样本性状相关性
  4. 筛选 与性状高度相关 的模块,分析此模块内部的基因,找到所需的目标基因

  • 同类方法比较:
  • 与普通聚类方法的不同:将基因表达值的相关系数取了 n次幂,使相关系数分布更加合理
  • 与其他共表达网络分析的不同:加入了软阈值、权重网络的概念

  • WGCNA 分析(属于预测范畴)步骤:
  1. 数据输入和数据清洗
  2. 建设表达网络和模块检测
  3. 筛选与表型相关的模块
  4. 使用 WGCNA 进行网络可视化

  • WGCNA 分析(属于预测范畴)步骤(详细版):
  1. 计算任意基因之间的相关系数 —— 为了衡量两个基因是否具有相似表达模式,需要设置 阈值 筛选
  2. 高于阈值就是相似的,但如果将阈值设为 0.8,就很难说明 0.8 和 0.79 两个是有显著差别的
  3. WGCNA分析时采用:相关系数加权值(对基因相关系数取N次幂),使得网络中的基因之间的连接服从 无尺度网络分布 (scale-freenetworks),这种算法更具生物学意义
  4. 基于基因相关系数,构建分层聚类树,聚类树的不同分支、不同颜色代表不同的基因模块
  5. 基于基因的加权相关系数,将基因按照表达模式进行分类,将模式相似的基因归为一个模块
  6. 几万个基因通过基因表达模式,被分成了几十个模块,是一个 提取归纳信息 的过程
  7. 得到模块之后的分析: 模块的功能富集、模块与性状的 相关性、模块与样本的 相关系数 
  8. 挖掘模块的关键信息:找到模块的核心基因、利用关系预测基因功能

二. WGCNA 实例及总结

  • 此节包含了 —— 表达谱文件 + 样本性状文件,总结了 WGCNA 使用流程

2.1 导入表达谱数据 + 样品性状数据

  • Mine:
  • 表格内容:每个基因在不同组织当中的表达值
  • 表头是样本信息(比如花生哪个组织采样,叶子、花等等),第一列是花生基因ID
  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第1张图片

  • Example:
  • 表达谱矩阵可看出:有 3600个基因、136个样本;
  • 样品性状矩阵可看出:有 361个样本、7个性状;
————————————————————————————————————————————————————————————————————
Mine:
————————————————————————————————————————————————————————————————————
// 加载 WGCNA软件
library(WGCNA)
options(stringsAsFactors = FALSE)

// 允许R语言程序最大线程运行
allowWGCNAThreads()

// 调换文件打开根目录
> setwd("D:/Desktop/Desktop/大创") 

// 检查当前根目录
> getwd() 
[1] "D:/Desktop/Desktop"

// 读取 txt 数据文件,并赋值给 dataExpr变量
> dataExpr <- read.table('FPKM_qu0_name1_qulie.txt',sep = '\t',header = TRUE)

// dim():查看变量维数
> dim(dataExpr)

// 52688 个基因,55个样本
[1] 52688    55
————————————————————————————————————————————————————————————————————
Example:
————————————————————————————————————————————————————————————————————
dataExpr <- read.csv(file = "Sample_Expr.csv") // 表达谱文件
dim(dataExpr) // 表达谱矩阵
[1] 3600  136

dataTraits <- read.csv(file = "ClinicalTraits.csv") // 样本性状文件
dim(dataTraits) // 样品性状矩阵
[1] 361   7

2.2 数据预处理

  • 通过过滤低表达量、低变异系数的基因,以减少参与后续分析的基因数目,提高结果可靠性
  • 由于实验数据的特殊性,就不做前一步处理了
  • 将矩阵写为符合 WGCNA 要求的形式:行名为 gene,列名为样品
  • 让性状数据和表达谱数据保持一致(一一对应)
// as.data.frame():将已存在的数据转为数据框格式;
// t():将行列数据转置
dataExpr <- as.data.frame(t(dataExpr))

// colnames():修改矩阵的列名
colnames(dataExpr) <- dataExpr[1,]
dataExpr <- dataExpr[-1,]

// unlist():将list结构的数据,变成非list的数据
// as.numeric:转为数字格式
dataExpr <- unlist(apply(dataExpr, 1, as.numeric))

// $Mice:缺失值填补
// match(x,y):返回一个和 x 长度相同,同时和 y 中元素相等的向量
match_trait <- match(rownames(dataExpr), dataTraits$Mice)
rownames(dataTraits) <- dataTraits$Mice

// c(): 将括号中的元素连接起来,不创建向量,c(1, 2:4),结果为 1 2 3 4
// paste(): 连接括号中的元素,创建向量,paste(1, 2:4),结果为 “1 2” “1 3” “1 4”
Traits <- dataTraits[match_trait, -c(1,2)]

2.3 筛选合适的阈值

  • Mine:
  • 选一个合适的值,使样本变为一个无尺度分布:
  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第2张图片
  • 少部分基因处于绝对优势的位置(表达量高),大部分处于劣势(表达量低)
  • 对基因间的相关系数取幂指数,最终确定合适的阈值
// 选择一组阈值 把 1-20 写成数组赋值给 powers
// seq():seq(2,10,2),会生成一组数:2 4 6 8 10
powers <- c(c(1:10), seq(from = 12, to=20, by=2))
sft <- pickSoftThreshold(dataExpr, powerVector = powers)

// 绘制结果图
par(mfrow = c(1, 2))
plot(sft$fitIndices[, 1], 
     -sign(sft$fitIndices[, 3]) * sft$fitIndices[, 2],
     xlab = "Soft Threshold (power)", 
     ylab = "SFT, signed R^2", type = "n", 
     main = paste("Scale independence"))
text(sft$fitIndices[, 1], 
     -sign(sft$fitIndices[, 3]) * sft$fitIndices[, 2],
     labels = powers, col = "red")
abline(h = 0.9, col = "red")
plot(sft$fitIndices[, 1], 
     sft$fitIndices[, 5], 
     type = "n", 
     xlab = "Soft Threshold (power)",
     ylab = "Mean Connectivity", 
     main = paste("Mean connectivity"))
text(sft$fitIndices[, 1], 
     sft$fitIndices[, 5], 
     labels = powers, col = "red")

  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第3张图片
  • 根据上图中的红线位置,确定 power 阈值选为7,R²  = 0.9
  • WGCNA 建议的阈值,输入sft 查看,列表第一项就是估计的最优值
  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第4张图片

  • Mine:
  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第5张图片

2.4 分割模块,作网络图

  • 分割模块:
  • 采用动态剪切树算法(dynamic tree cutting),分为两种:
  1. 一步法:简单明了,一步出结果
  2. 分步法:细调参数,以达到满意结果
  • 官网没说哪种适合什么条件,都可以用,参考如下:
  • http://blog.sina.com.cn/s/blog_61f013b80101lcpr.html
net <- blockwiseModules(dataExpr, power = 7, maxBlockSize = 5000,
               TOMType = "unsigned", minModuleSize = 30,
               reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
               numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
               saveTOMs = TRUE,
               saveTOMFileBase = "FPKM-TOM",
               verbose = 3)
moduleLabelsAutomatic <- net$colors
moduleColorsAutomatic <- labels2colors(moduleLabelsAutomatic)
# A data frame with module eigengenes can be obtained as follows
MEsAutomatic <- net$MEs

  • 展示网络图:
plotDendroAndColors(net$dendrograms[[1]], moduleColorsAutomatic[net$blockGenes[[1]]],
            "Module colors",
            dendroLabels = FALSE, hang = 0.03,
            addGuide = TRUE, guideHang = 0.05)

  • Example wgcna_module:
  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第6张图片
  • Mine:
  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第7张图片

2.5 关联模块与表型,作相关系数图

  • 结合模块与样本性状的相关性来分析,将模块与表型关联:
nGenes <- ncol(dataExpr)
nSamples <- nrow(dataExpr)
#same to MEsAutomatic
MEs0 <- moduleEigengenes(dataExpr, moduleLabelsAutomatic)$eigengenes
#ME(module eigengene)
MEs <- orderMEs(MEs0)
modTraitCor <- cor(MEs, Traits, use = "p")
modTraitP <- corPvalueStudent(modTraitCor, nSamples)
  • 然后做模块与表型相关系数图:
textMatrix <- paste(signif(modTraitCor, 2), "\n(", signif(modTraitP, 1), ")",sep = "")
dim(textMatrix) <- dim(modTraitCor)
par(mar = c(6, 5.5, 3, 3))
labeledHeatmap(
    Matrix = modTraitCor, xLabels = names(Traits), yLabels = names(MEs),
    ySymbols = names(MEs), colorLabels = FALSE, colors = greenWhiteRed(50),
    textMatrix = textMatrix, setStdMargins = FALSE, 
    cex.text = 0.7, zlim = c(-1, 1), main = paste("Module-trait relationships")
)
  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第8张图片
  • 图中,y轴是模块名,x轴是性状,每个模块都跟每个性状有一个空格,空格的上部分是模块与性状的相关系数,空格的下部分是一个p值,代表相关系数的显著性

  • 其实随着 WGCNA 的广泛使用,其用处不仅局限于对性状的分析,还可以结合模块与样本的相关性来分析
  • 比如当研究不同处理组织或者不同发育时期的植物时,如果想了解处理或者不同时期中那些模块对其有显著影响,那么我们可以自行构建类似于性状的 Traits 矩阵
  • 最简单的一种方法就是:默认为各个样本间是无关联的,那么Traits 矩阵则为标量矩阵,当然还有其他方式(比如考虑样品有生物学重复的情况)

2.6 根据模块间的相似性及向异性,作树杈图

  • 查看每个模块之间的相似性以及向异性,并作树杈图
dissimME <- (1-t(cor(MEs, method="p")))/2
hclustdatME <- hclust(as.dist(dissimME), method="average" )
# Plot the eigengene dendrogram
plot(hclustdatME, main="Clustering tree based of the module eigengenes")
  • wgcna_hclust:
  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第9张图片

2.7 查看特定模块中的特定基因与特定形状关系

  • 查看特定模块中的基因对于特定性状是否具有高GS值(gene significance)和MM值(module membership)
  • 以 weigth 为例:
  1. 需要先计算每个基因在每个模块中的KME值
  2. 然后再计算GS值
  3. 最后作图
MEs0 <- moduleEigengenes(dataExpr, moduleColorsAutomatic)$eigengenes
weight <- as.data.frame(Traits$weight_g)
names(weight) = "weight"
GS.weight = as.numeric(cor(dataExpr, weight, use = "p"))
MEs <- orderMEs(MEs0)
datKME <- signedKME(dataExpr, MEs)
ME2Column <- substring(names(MEs), 0)
column <- match("MEblack", ME2Column)
restModule = moduleColorsAutomatic == "black"
verboseScatterplot(MEs[restModule, column], GS.weight[restModule],
                   xlab = paste("Module Membership ","black", "module"),
                   ylab = "GS.weight", main = paste("kME.", "black", "vs. GS"), col = "black")
  • wgcna_GC_MM:
  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第10张图片

2.8 最后导出模块中 TOM值 的数据,导入 cytoscape 作图

  • 最后导出模块中TOM值的数据,导入 cytoscape 作图:
TOM <- TOMsimilarityFromExpr(dataExpr, power = 7)
# Select modules需要修改,选择需要导出的模块颜色
modules <- c("black")
# Select module probes
probes <- colnames(dataExpr)
inModule <- is.finite(match(moduleColorsAutomatic, modules))
modProbes <- probes[inModule]
# Select the corresponding Topological Overlap
modTOM <- TOM[inModule, inModule]
dimnames(modTOM) <- list(modProbes, modProbes)
# Export the network into edge and node list files Cytoscape can read
cytoscape <- exportNetworkToCytoscape(modTOM,
                               edgeFile = paste("FPKM-One-step-CytoscapeInput-edges-", paste(modules, collapse="-"), ".txt", sep=""),
                               nodeFile = paste("FPKM-One-step-CytoscapeInput-nodes-", paste(modules, collapse="-"), ".txt", sep=""),
                               weighted = TRUE,
                               threshold = 0.2,
                               nodeNames = modProbes,
                               nodeAttr = moduleColors[inModule])
  • 并做一个TOM图,如下:
dissTOM <- 1 - TOM
plotTOM = dissTOM^7
diag(plotTOM) <- NA
geneTree <- net$dendrograms[[1]]
TOMplot(plotTOM, geneTree, moduleColorsAutomatic, main = "Network heatmap plot, all genes")
  • wgcna_TOM:

  • WGCNA 分析 —— 安装及概念介绍、简单应用及总结_第11张图片

2.9 用 cytoscape 将上述特定模块中的基因以互作网络图形式展现,以一定的标准来选择 hub gene 作为后续研究的重点

  • 也可以对模块中的每个基因进行注释,做GO以及KEGG富集
  • 根据富集到的通路,结合模块信息来确定哪个模块的基因作为后续研究的重点

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