2022.04.14【读书笔记】|WGCNA分析原理和数据挖掘技巧
文章目录
- 背景
-
- RNA-seq分析一般逻辑
- 局限性
- 基因表达和调控方式
- 与网络相关的基础概念
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- 无尺度网络
- 模块以及模块特征值
- 连通性
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- 非权重网络
- 权重网络
- 核心基因
- WGCNA网络原理和构建过程
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- 简介
- 哲学理念
- 网络构建的两个核心步骤
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- 基因的过滤
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- 去除低丰度的基因
- 去除没有变化的基因
- 最终期望：
- 一个务实的策略——双重标准：
- 计算基因间的相关性
-
- 基因相关关系的无尺度化
- 关键参数β的确定
- 基因间表达调控的相关性
- 将基因划分为模块
- WGCNA网络生物学意义的挖掘
-
- 目标模块选取
-
- 模块表达模式分析
- 模块与其他指标的相关性分析
- 富集分析（常见为功能富集分析）
- 从目标基因直接入手
- 模块内的分析
-
- 模块内连通性（Module connectivity）
- 核心基因分析
- 目标基因相关的局部调控网络
- 关注特定类型的基因
- 总结
-
- 工具推荐
- 样品要求
- 步骤
- 特点
背景
RNA-seq分析一般逻辑
1.上下调
2.趋势分析
对分类基因开展功能、调控分析
局限性
大样本情况，无法进行有效分类
依赖数据的功能分析无法推测新的调控关系
基因表达和调控方式
1、组成型表达（constitutive gene expression）
细胞中持续进行的基因表达，且较少受环境因素的影响。这类基因通常被称为持家基因（housekeeping gene）。
2、基因间相互诱导和阻遏表达
即一个基因诱导（例如转录因子）或阻遏（例如 miRNA）另外一个基因的转录翻译。
3、协调表达
在一定机制控制下，功能相关的一组基因，协调一致，共同表达。
与网络相关的基础概念
网络图的两大元素：
• 点：图中每一个圆圈代表一个节点，如基因。
• 边：在基因调控网络中，基因相互间的调控关系构成了边。
无尺度网络
无尺度网络：大部分节点只和很少节点连接，而有极少的节点与非常多的
节点连接。
数学上的描述：假设m为某节点的连接数。统计所有基因的m值，然后以
m高低为指标对所有基因分类。n为节点连接数为m的基因的数量。m与n
应该成反比。
模块以及模块特征值
模块(module)
表达模式相似的一组基因。趋势分析的本质也是分模块，但其功能没有WGCNA中的方法强大。
模块特征值（module eigengene）
模块中的所有基因进行PCA分析，得到的主成分1（PC1）的值。PC1相当于模块中所有基因表达量的加权，可以代表这个模块的表达模式。
连通性
一个基因与其他基因的连接程度（通常只在模块内计算）。常称为
connectivity或degree，或用数字k表示。有两种计算方法：
非权重网络
当两个基因的相关性大于某个值（例如0.6），才认为有相关性。最后某个基因的k值等于与其相关的基因的数量。红圈中的基因k=3。
权重网络
所有两两基因的相关性都被保留（无论强弱）。某个基因的k值等于其与各个基因的相关性之和。红圈中的基因k=四个相关性之和。
核心基因
在一个模块中，连通性（k值）排名靠前的基因。K值排名靠前本身已
经表明它们处于中心枢纽的位置。如下图中的A基因。
WGCNA网络原理和构建过程
简介
WGCNA，全称weighted gene co-expression network analysis，即权重基因共表达网络分析。自2005年B Zhang, S Horvath等提出，至今已被引用2268次。在疾病以及其他性状与基因关联分析等方面的研究中被广泛应用。
哲学理念
从“系统”的角度去解析关注的问题，而不是去罗列单一基因的清单。
– 描述整个“发动机”的工作原理，而不是去摆放所有的螺丝钉。
• 研究的关注点是基因模块，而不是单一基因。
• 网络的概念让抽象的生物学问题更直观易懂。
网络构建的两个核心步骤
基因的过滤
基因的过滤并没有统一标准；
不要使用所有基因，原因：1）计算慢；2）上限是4万；3）一些基因没有意义，例如低丰度、没有变化的基因等；
一般的基因过滤标准：
去除低丰度的基因
范例举例：
表达量在所有样本均小于1的基因；
表达量在 x % 样本=0的基因，且最大值小于1。
注意，要具体问题具体分析。例如，50%样本 =0 这个标准，对随机群体
可能是合适的。但如果样本是病例组：对照组，那么50% 样本 = 0 则可能是非常有意义的基因。
去除没有变化的基因
在样本数巨大情况下，差异基因并集策略是没用的（因为等于没过滤）
采取计算变异系数，然后过滤掉最低的x% 是更适用的策略
最终期望：
基因数量在几千~2万以内；
要包含老师关注的基因（的确，很多情况老师一开始不知道自己要什么，发现没有后，要求重新过滤分析）
一个务实的策略——双重标准：
按照一定标准过滤；
然后加入老师潜在关注的基因（例如可以提前提供，或不可避免重新分析的时候加入）；
计算基因间的相关性
基因相关关系的无尺度化
处理过程
1）原始S矩阵：Sij=|cor (xi, xj)| # 计算基因间两两相关性
2） 无尺度化（拉大贫富差距），确定最佳β值，得到A矩阵
A矩阵： aij=power (Sij, β)=|Smn|β
注：在WGCNA中，应该只考虑正相关的基因。幂函数处理的作用：
a）在幂函数处理后，少量强相关性的关系（例如：r2=0.999）不受影响或影响较少，相关性弱的关系（例如：r2=0.1）取n次幂后，相关性下降明显。
b) 最后导致网络关系无尺度化：强相关的关系少，弱相关的关系多；
连通性高的基因少，连通性弱的基因多。即，满足上文提到的无尺度网络的定义“假设m为某节点的连接数。统计所有基因的m值，然后以m高低为指标对所有基因分类。n为节点连接数为m的基因的数量。
m与n应该成反比。
备注： 基因i的连通性： 
即其与其它基因的相关性之和。
关键参数β的确定
β值：WGCNA分析的第一个关键参数。
左图：不同β值下，m与n的相关性的变化（上一页提到，理论上是负值，应该做过转换）。一般认为取β值大于0.8或到达平台期时最小的β值用于构建网络。
右图：不同β值下，所有基因连通性的均值。
β值：但不应该死抱β值大于 0.8这个标准。
（1）数据由于噪音等其他因素，可能会β值早早到达平台期（例如 0.6），那么我们应该接受这个情况；
遇到过一些数据噪音极大的情况，β值上下剧烈波动；
过滤掉一个低丰度的基因，是个值得尝试的策略；
（2）β值不宜取太大，例如 大于 20；
基因间表达调控的相关性
3）如何评估两个基因的表达模式的相关性
生物学逻辑：调控的相关性=直接相关 + 间接相关
数学实现过程：基于A矩阵,计算两两基因间的TOM值
详析TOM值 ：TOM值= 直接相关 + 间接相关（强化直接相关的值）
将基因划分为模块
层级聚类树与区分模块
聚类和分模块的几个关键参数
调控网络中的各个定义
点和边的定义已经介绍过；
Degree（度），又称为连通性（Connectivity）,即1个基因拥有的边（调控关系）的数量；
注：
1）WGCNA中，连通性是各个边的相关系数（0~1）之和；
2）cytocape软件中有1个定义——Neighborhoodconnectivity指的是相邻基因连通性，而不是这个基因本身；
Hub gene：在1个调控网络中，位于中心的基因，即连通性排名靠前的基因。
WGCNA网络生物学意义的挖掘
目标模块选取
模块表达模式分析
模块特征值（即PC1）在各个样本中的丰度，构成了这个模块的表达模式/规律
模块与其他指标的相关性分析
1个模块相当于代表一类基因，模块的特征值可以某种程度上代表一类基因的表达模式
样本在各个模块特征值可以和样本的性状开展相关分析，找出与特定性状相关联的模块
模块也可以其他信息开展相关性分析，例如 样本SNP基因型，样本分组信息关于样本的相关性：对分析与某类样本的相关性的时候，可以将目标类型定义为1，其他类型定义为0.
富集分析（常见为功能富集分析）
如上文提到的 存在诱导/阻遏表达（TF和靶基因）或协调表达（例如被同一个TF调控一组基因）关系的一组基因，更容易出现在一个模块中。而且在大样本的情况下，基因的表达分类更加有规律。
所以，对模块开展KEGG、GO功能富集分析，通常会找到很有规律的功能类型。
从目标基因直接入手
当然，如果有目标基因，也可以直接找其所在的模块，然后进行进行下一步分析——模块内的功能调控关系分析
模块内的分析
模块内连通性（Module connectivity）
WGCNA模块内输出的Connectivity是模块内的连通性，是这个基因与其他基因相关性之和（记住：是aij，而不是TOM之和），所以这是软阈值（soft threshold）的计算方法（请回顾上文）。
在某些文章里，也会使用硬阈值（hard threshold）的方法，即认为TOM值（就是模块调控关系表中的weight值）大于X（默认是0.15）的两个基因才认为是相关的，然后计算每个基因的连接数量（可以先过滤有足够强度的关系，然后导入cytoscape或OS-tools计算）
我们比较推荐使用前者。
核心基因分析
模块中连通性较高的基因（例如人为设定排名前30或前10%），被称为hub基因。
高连通性的Hub基因通常为调控因子（调控网络中处于偏上游的位置），而低连通性的基因通常为调控网络中偏下游的基因（例如，转运蛋白、催化酶等）
我们应该按照自己研究目的，充分利用连通性这个信息。
目标基因相关的局部调控网络
从目标基因入手，找与之TOM值排名靠前（例如前10）或TOM值大于某个阈值的基因列表。通过这一策略，可以准确筛选潜在与目标基因存在调控关系的候选基因，这些基因是下阶段功能验证的优先候选。
从目标基因入手，找与之TOM值排名靠前（例如前10）或TOM值大于某个阈值的基因列表。后者是更稳定的策略。因为如果目标基因不是Hub基因（而是下游的基因），那么与其TOM值大于0.15或0.3 的基因是非常少的。因为间接相关的基因太少，与其相关的TOM值不会太大。
使用多类信心进行筛选：
1）如果目标基因是下游基因，则可以找共同的上游调控基因；
2）如果目标基因是上游基因或hub基因，则可以挖掘共同调控的下游基因；
3）结合转录因子等其他注释信息，也有利于解读。
绘制策略
1）确定目标基因（这里是3个）
2）筛选与每个目标基因TOM值排名前n的其他基因（这里取n=10）
3）图形中的调控关系，只画目标基因与其他基因的关系，但不画其他
基因与其他基因的关系，避免图形过滤冗杂
关注特定类型的基因
可以结合基因注释信息，关注模块内特定类型的基因，例如转录因子。
以上的大部分图形（除网络图），都是WGCNA R包可以输出。
• 网络图的必须自己定制：
（1）筛选目标基因（核心基因，已知目标基因）
（2） 筛选与目标基因相关的调控关系/基因（TOM值过滤）
（3） 整合多种信息，如目标调控关系、TOM值（调控强度）、连通性、基因种类（如转录因子），结合绘图软件（cytoscape或 OS-tools网络图工具），就可以将以上得到的信息图形化。
总结
工具推荐
本地版Cytoscape教程：
第19期在线交流cytoscape介绍与实操【视频】
OS-tools 在线版cytoscape（做过优化，更适应cytoscape的原始输出结果和简单的数据过滤）
样品要求
- WGCNA分析对样本有什么要求？
答：
我们推荐以下的样品数：
1）不含生物学重复的独立样本组：样本数≥8
2）包含生物学重复的样本组：样本数≥15
主要考虑的因素：
1）样本必须包含丰富的变化信息，才能区分为多个有意义的生物学模块（需要多个独立处理组）。
2）必须保证有多个样本，才能保证相关系数计算的准确性。
步骤
关系矩阵构建
基本原理: 利用基因间表达量的相关系数。
模块识别
基本原理：利用拓扑树结构区分基因模块。
核心模块挑选
基本原理：分析模块内基因的特性，进一步寻找有生物学意义的模块。
分析策略：模块特征值与表型间的相关性，模块内基因的KO、GO分析。
核心基因的挑选，并构建网络
基本原理：利用基因连通性信息挑选核心基因，并围绕其构建网络
特点
WGCNA 是一种系统的遗传分析方法，十分适用于分析
复杂性状/疾病：
1）基于RNA表达量的调控关系分析，不需要基因间作用关系的先验信息。
2）强调模块 (通路)，而不是单一基因。
精简了组学水平的海量信息
在与其他信息（如表型）的相关性分析中，减少了多重检验校正的影响。
注：几十个模块的相关性分析 vs 几千个基因的相关性分析
3）使用基因连通性便于找到核心基因
核心基因在功能实验中往往有更高验证率。
4）调控网络相对稳定，受样本量影响小
相关调控网络基于相关系数，而不是p value（p value受样本量影响大）。因此，保证来源不同，样本数不同的数据间的可比较性