PBMC外周血淋巴细胞分离培养方法

主要试剂：

(1)1640培养基 

(2)胎牛血清（FBS）

(3)Human GM-CSF

(4)Human IL-4 

(5)Human TNF-a

(6)PBS

(7)青霉素-链霉素溶液（100X）

(8)DMSO

(9)台盼蓝粉末

(10)人外周血淋巴细胞分离液 

 

主要试剂配制

（1）PBS：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，高压灭菌，4℃保存备用。

（2）RPIM-1640培养基：临用前根据需要加15%胎牛血清，最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。

（3）台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100mL，1500rpm离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。

实验步骤

一、PBMC原代分离步骤

1) 抽取人的外周血于肝素抗凝管中，取足5mL新鲜血液，加入PBS按1：1稀释血液（一般采血管2mL+2mL）。

2) 取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用。

3) 吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。

4) 室温，离心2000rpm，20min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。

5) 小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。

6) 去上清液，加入1640培养基1mL混匀，取少量进行细胞计数。

7) 用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，5-10min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。计数200个细胞，计算活细胞百分率，活性应在95％以上。

 

二、DC细胞诱导

1) 将收集的PBMC在1640培养基，在37 ℃、5 % CO2条件下在培养板培养4h。

2) 轻轻吸取上清，收集贴壁细胞，加入含15%血清，100ng/ml rhGM-CSF、100ng/ml rhIL-4的1640培养基，培养5～7d获得未成熟DC，用25ng/ml hTNF-α刺激2～3天，获得成熟DC。

3) 用倒置显微镜观察细胞形态，至细胞毛刺样突起，有典型DC形态悬浮细胞。

三、注意事项：

细胞最好在细胞贴壁注：分离后细胞最好在贴壁后当天换液（贴壁细胞贴壁能力很弱，润洗时轻柔），过夜后部分细胞漂浮，细胞得率减少。