3D完整空间蛋白组学

文章地址：https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S0092-8674%2822%2901465-9
2022年12月22日德国马普所 Matthias Mann教授在Cell 上发表了3D空间蛋白组学技术在小鼠和人类器官中的应用，这篇文章真可谓是充分体现了多学科交叉，不仅将AI技术熟练的应用，而且还开发了相关的取样机器人，让文章的高度和档次瞬间提升了N个level。

本文中用到的多种技术：包括全器官和组装透明化处理和成像、深度学习的图像分析、机器人组织提取技术、高灵敏度的质谱技术。
通过超高分辨率的质谱，单细胞蛋白组学也在该领域深入的发展着。
在这里作者通过结合全组织透明化技术和超高分辨率的MS质谱技术从少于100个细胞的样本中分析蛋白组学。作者将这项技术称为基于质谱技术的3D透明器官成像术（DISCO-MS）。同时，为了协助组织提取，作者发明了机器人组织提取系统（DISCO-bot）。

（一）基于质谱技术的组织透明化蛋白组织学
采用3DSICO技术和uDISCO透明化的方法（常用的两种透明化方法），采用新鲜的组织作为对照，作者分析新技术对于蛋白组学的分析是否失真。测试了几种蛋白溶解的方法后，作者发现，SDS基于的蛋白溶解和组织粉碎法再进一步采用SDS重溶解和蛋白消化能够使得基于溶解透明化的组织达到与新鲜组织相似的蛋白量，无论是定量还是定性。通过这一方法，作者获得了5500个蛋白质，并且皮尔森相关系数在0.89到0.99之间。
因为经过3DISCO和uDISCO处理过后的样本，内部的荧光信号不稳定，因此作者进一步的改进了这些方法，通过荧光染料连接一个纳米体得到了vDISCO技术从而增强内部的荧光信号。作者进一步的用这几种方法得到的蛋白组进行相关性分析，得到的相关性系数在0.85-0.94之间。

接着，作者对在福尔马林浸泡了5年的人脑组织通过DISCO和SHANEL方法进行分析，DISCO-MS方法获得了5000多个蛋白，获得了与多聚甲醛PFA固定的对照组类似的高质量可重复的结果，R值在0.91-0.96。因此作者认为他们的技术能够获得比新鲜组织和PFA固定的组织更高深度和精度的蛋白。

（二）在vDISCO透明化的组织中具有高的蛋白质组产生
接下来，我们继续深度检测vDISCO透明化组织的蛋白组学来研究通过透明化组织技术导致的蛋白丢失相比于新鲜组织，作者在具有生物学重复的样本中发现了将近8000个蛋白质，具有非常高的重复性新鲜组织和透明化组织间变异系数低于0.2，表明经过vDISCO技术透明化的样本中蛋白质的产量和质量与新鲜组织相似，且具有非常强的可重复性。作者分析二者间蛋白在GO上的差异，发现发生改变的仅仅是blood microparticle。

（三）微解剖组织的蛋白质组三维成像

在建立了高质量可重复的MS-样本制备流程技术体系后，作者使用这种无偏倚的技术去分析小靶标组织（约0.0005mm3），在这个过程中，作者遇到三个挑战：（1）通过3D成像技术确认的透明化组织小区域的解剖可靠性；（2）仅仅从少量纳克级别的解离和快速溶解透明化组织进行深度蛋白组学是否可靠？（3）将小组织区域配准到完整的3D光片图像堆栈上。为了解决第一个问题，我们开发了一系列的步骤，使得透明化的组织变得柔软，以便在不变形的情况下进行预冷冻切片和激光捕获显微解剖。简言之，作者逆转了透明化的步骤，逐步再水化透明化组织，冷冻保藏。这项操作使得冷藏的部分避免断裂，并允许我们获得小于0.0005立方毫米的激光纤维切片组织，大约有60个细胞。接下来，作者进一步的微小化他们的样本准备流程，并进行基于质朴技术的分析，采用经一种改进的俘获离子迁移质谱平台技术，最高灵敏度可达到单细胞水平。最后作者自动的将2D的LCM成像返回到3D光片成像堆积技术上。

然后通过一片一片的重构获得光切片堆积部分，最高得分的部分，作者将其命名为感兴趣的区域ROI，并将其作为3D光片成像数据。

进一步为了探索作者技术在生物学应用中的潜能，作者采用中度损伤的脑组织mTBI小鼠模型去鉴别和分析包含有局部脑部炎症的脑部区域的蛋白组学。mTBI和脑震荡是常见的损伤会导致长期的病态，包括睡眠紊乱和神经系统紊乱甚至是早期的痴呆。他们都具有长期慢性炎症的特点，而这会导致在选择的脑区的退行性神经变病变，尤其是沿着延伸的轴突部分。作者采用重复的mTBI损伤模型在CX3CR1-EGFP小鼠，这种小鼠的采用了EGFP融合标记。这种轻微损伤的通过行为学表现（如巴尔纳斯迷宫和跳梁行走）进行验证，发现没有显著性的改变。CX3CR1-EGFP小鼠通过vDISCO标记和透明化处理在8周损伤的时候，展现了小胶质细胞在切片区的活性。ClearMap定量坚定了活性的形态扩大的微小胶质细胞在多处脑区域，特别是沿轴突束。在Thy-GFP-M受体的mTBI小鼠模型中，在相同的脑区域也检测到了轴突的异常。
然后作者使用DISCO-MS技术对分离的ROI包括局部激活的微小胶质细胞也被称为空间信息。从小于0.0005立方毫米的视神经束分析树状的ROI和相同对照组区域，作者发现了每个ROI区域约有将近1400个蛋白质。总的来说，作者发现了602个常见的蛋白在每个ROI区域在所有的mTBI和对照组的组织，相比于来自mTBI区域的ROI，作者发现共享的蛋白组学特点由717个蛋白构成，每个ROI有一套独特的蛋白特征。PCA分隔的mTBI和对照组的ROI区域的蛋白组学，发现几个与轴突损伤和修复相关的蛋白在不同的条件下，显示出明显的差异调控。

并且作者发现几个与脑损伤mTBI有关的蛋白确实在mTBI组高表达。

**（**四）深度学习技术用于扫描和强劲的病理学鉴定

AD病理的一个早期症状是α-β淀粉斑的聚集，因此作者希望能够通过这无偏倚的技术检测到淀粉斑，然后可以继续使用DISCO-MS技术对其进行无偏倚的蛋白组学分析，从而为AD起始阶段的病变提供深入的洞见。为了实现这一目标，作者对5xFAD的AD小鼠模型去鉴定年轻小鼠脑部刚果红标记的Aβ淀粉斑。
由于起始斑块的位置不知，作者开发了深度学习技术去鉴别所有的Aβ斑在小鼠的全部脑部区域。简言之，作者的网络结构是基于U-Net的，一个已经成熟建立的生物影像分析方法。

为了评估作者取样节段的质量，作者计算了很大范围内立体像素的Aβ斑的特点。作者发现他们的基于深度学习的DL架构对于自动的Aβ斑块的检测展现出超高性能。容积准确率达到0.99，容积率达到0.71表面达到0.94，整体的戴斯值达到0.89。在使用DL分割整个大脑中的所有斑块后，我们将数据记录到Allen大脑图谱中，以获得超过1000个大脑子区域的区域量化。然后进一步按照Allen脑图谱的本体论的将它们分为主脑区和其他区域在疾病早期（6周）和晚期（6个月）进行简化和随后的可视化。使用的是开源的Python包brainrender软件。

作者DL模型见证少数的Aβ斑在6周大的小鼠脑中，鉴定了几千在疾病晚期的时候，然而斑块在5周的时候就缺失了。在6周的小鼠相同脑部区域，我们也通过免疫荧光鉴定了我们发现的Aβ斑。相比于6周和6个月的5xFAD小鼠在1238不同的脑区域，根据Allen脑地图，我们发现了72个主要脑区域，并绘制了27个疾病相关的区域。主脑的一些区域带有初始的斑块是反转录区域，髓质和小脑皮质，纤维层和脑下脚以及视觉区和海马体形成区的分子层面。疾病晚期（6个月）脚下脑区域和反转录区域显示出更大量的斑块数量，分别达到1689和10630个。作者观察到更大的斑块在中脑（约3438立方微米），接着是临时相关的区域（2450立方微米），后部的杏仁核2450立方微米，听力区的2366立方微米，在早期的平均的体积在2000立方微米到3500立方微米之间。有趣的是这些地方的斑块的体积，在6个月的时候明显的降低，表明斑块临时形态学的改变，以及由于周围微环境或者潜在的疾病进展带来的不利生物学效应所影响。

在基于DL的鉴定的早期Aβ斑块的5xFAD小鼠模型中，我们分离了来自海马体的四个ROI，同样也分析了对照组小鼠脑相同的部位，然后用于质谱分析。作者比较了所有重复中的2000个蛋白，并用PCA分析了分隔的带有Aβ的ROI区域，差异表达显示许多具有特点的AD相关的蛋白富集在5xFADde ROI区域，并包含Aβ前体蛋白（约32倍），以及Aβ斑块早期成员S100a11（一种钙离子结合蛋白家族成员）。

此外作者也分析了早期Aβ斑块内ROI在多大程度上具有相似性。每个ROI拥有超过1200个蛋白，其中各个ROI共享的蛋白有768个，定义了一个核心的早期Aβ斑形成的蛋白组分。早期Aβ时期共有蛋白主要是Ywhaz和S100a蛋白家族的成员。作者也发现了涉及早期AD病变的其他蛋白如Mapt-4和5，描绘了基于MS特异性的蛋白质谱。作者的蛋白质谱数据揭示了早期Aβ斑的变异性尽管有鉴定的非常好的AD蛋白（Mapt和Tmed10 和App）,我们通过免疫荧光确认了S100a11和Thop1在早期病变斑块中的存在，而这些蛋白在野生小鼠体内相同的区域并不存在。

我们进一步的比较了脑下脚背侧和腹侧的斑块区域相邻的非斑块区域，那些区域是初始斑块形成的区域。作者发现了29个蛋白质上调而14个蛋白下调。在其他的改变的蛋白中，作者发现了他们与囊泡融合，囊泡介导的运输以及Bnip分泌途径有关，它们中的一些蛋白都是早期AD的标志蛋白。明确了斑块相关蛋白的在区域内的特异性调节方式，而这些之前仅仅是在没有精确定位的晚期AD中发现的。如Manf在晚期AD的APP/PS1转基因小鼠中上调表达，Actl6b涉及由染色体修饰导致的基因选择性激活和抑制在晚期AD的小鼠脑环境下。在人的Actl6b基因的突变与智力失调有关，表明该蛋白在早期退行性神经疾病中的作用。Mbp和Cnp还有Plb与髓鞘外壳的结构完整性有关。斑块对比于非斑块区域除了显著富集的蛋白，作者也发现了大量的亚区异质性的蛋白。此外，许多蛋白独特的分布在这两个亚区域，这能够以区域特异性的方式驱动疾病的进展，而这一观念由于技术限制，之前未被提出过。
接下来，我们以区域特异性的方式绘制了晚期斑块（6个月）微环境，同样也在早期斑块蛋白富集的组织进行了同样的操作。背部脑下脚区域展现了显著的蛋白富集，显著上调的蛋白达到49个，而下调的蛋白有21个。在这些上调的蛋白中，我们发现蛋白与S100a家族相关的蛋白S100a13完全激活，胶质细胞胞吞作用途径，以及Tau蛋白结合途径。作者也发现了在晚期背部脑下脚和腹部脑下脚显著的蛋白组学差异，表明时间特异性改变的区域有显著不同的蛋白图谱。总之，DISCO-MS允许我们精准确定早期和晚期的Aβ斑块在全脑的3D重构和分析它们的空间蛋白组学构成。我们恢复了许多之前在AD的A-β斑上的许多已知的标志物，以及在AD过程中很少被确认的蛋白，我们的数据表明了显著涉及S100a和Ywhaz蛋白和囊泡融合和转运的蛋白，髓鞘外壳的功能和补体系统相关家族成员在早期Aβ斑块形成中的作用。

（五）从DISCO-bot机器人提取组织样本中进行DISCO-MS分析
接下来，作者继续开发了DISCO-MS用于大量样本，包括 全部小鼠身体和人类器官。由于节段和成像用于LCM是不实际的对于大体积样本的扫描，因此作者开发了机器手提取系统即DISCO-bot，使用活检针进行取样分离ROI用于后后续的蛋白组学分析。这要求稳定的全鼠组织机器人提取系统（2）在提取的过程中，最小的活检针变形量；（3）活检针能够渗透到坚硬的透明组织。
首先，为了稳定样本，我们研究了 不同的树脂和琼脂浓度去操纵床的硬度以及和透明也的兼容性。成像和图像是2%的琼脂糖包埋能够很好的适用于我们的目的。接下来我们自定义不同的3D打印鼠容器的转换器以及针筒容器，根据他们的长项和力量缺陷标准并且选择拥有最少缺陷的。最后，我们尝试多种不同尺寸和形状和规格的针头并且发现针头18G和22G，提供了好的渗透和样本的精确提取而不受不想要组织的污染。我们进一步的优化了在光片显微镜中DISCO-Bot和工作污染。DISCO-bot系统的结果允许从透明组织提取小组织区域，而在成像的过程中，因此能够使得非破坏性和重复性的分离来为DISCO-MS而扫描。

为了展示DISCO-bot 在DISCO0MS中的应用流程，我们透明化LysM-eGFP小鼠通过使用vDISCO，通过使用PI进行细胞核染色去鉴别ROI然后使用DISCO-Bot 进行提取。全身成像技术使得我们能够空间鉴别LysM-eGFP细胞的定位，者大多是被发现在骨髓壁龛中。我们然后聚焦聚焦头盖和肩胛骨，两个骨头伴随着不规则的3D结构以及难以在标准的2D节段学习。我们选择三维ROI从头盖骨和六个ROI从肩胛骨，三个ROI来自中间的区域。DISCO-bot提取的ROI分析，然后按照使用DISCO-MS流程。在头盖骨，我们鉴别了共享1984蛋白的特征，在三个ROI具有皮尔森相关性在0.72个0.76之间。为了核实DISCO-bot提取物的精确度，我们比较了我们的从新鲜组织提取的蛋白质谱结果。我们发现大约2200共享的蛋白质在所有的2550个已经确认了的蛋白组，并与分离的头盖骨中的蛋白进行比较。确认了高精度的DISCO-bot的提取物。在这些蛋白中，早期展示的7个蛋白组被发现在蛋白水平和转录水平在新鲜的头盖骨中，在其中进一步正式证明了使用机械臂提取物的精准性。在肩胛骨处，我们观察到在中部和侧后骨处显著的LysM-eGFP水平。PCA能够明地将ROI分了两组，尤其是从中间边界那一块，表明了提取物间和内存在的异质性。作者在不同条件下，鉴别出来了1250个蛋白并且具有非常高的相关性（0.88-0.98）。并且发现了764个蛋白在侧和中后部分其中336和22个蛋白是独一无二的在各自分别的区域内，差异分析显示，上调的10个蛋白是与天然免疫和适应性免疫相关的比如抗原提呈分子H2-L以及B/T细胞受体通路等，细胞因子信号通路如STAT3，它们都涉及抗原提呈刺激的炎症反应通路。而在33个下调的蛋白中，涉及信号提相关蛋白Cops7a和蛋白相关的机动蛋白网络纤维形成相关的蛋白Fhod1。这些结果表明在通过从一端到另一端的扫描成像后，DISCO-MS能够用于小鼠全身去研究空间分子异质性和多样生物学。

（六）空间蛋白组学分析SHANEL-透明化处理后的冠状动脉情况
接下来，作者验证了DISCO-Bot辅助的DISCO-MS技术在冠状动脉疾病中的应用。急性心肌梗塞是心血管死亡的主要原因，也是导致世界上死亡的主要原因。当动脉粥样硬化斑在动脉血管的内侧逐渐堆积，然后导致血管突然破裂导致血栓形成，阻挡动脉，最终阻止全身血液流动。近期单细胞RNA测序技术的快速发展为深入了解疾病和健康状况下的心肌细胞提供了理论基础，但是却缺乏精确的空间信息。然后转录水平可能与蛋白水平之间存在弱的相关性，甚至是在单细胞水平。
作者获得了PAF固定的人类心脏，使用右旋糖酐（dextran）标记血管，使用SHANEL技术透明化处理中整个心脏。这很容易定位沿同一冠状动脉中没有斑块的区域的任何大小的钙化动脉粥样硬化斑块。
作者在大斑块相关区域提取了6个ROI区域，也从没有到少量斑块的区域提取了6个ROI区域，这能够代表早期斑块形成沿着相同心脏区域的冠状动脉形成，从而用于后续的DISCO-MS的分析，在每个ROI区域，作者找到1300个蛋白，并且发现53个下调和6个上调的，系统的GO分析发现相关蛋白的通路分析表明与心肌肥大调控和心肌肌肉收缩相关（如TPM1/2和MYL2/3），黏着斑，血液凝固、细胞浆源激活，血小板聚集，纤维抗原复合物，凝血级联反应。这些蛋白中的一些以区域特异性的方式调节着相关的过程，比如MYH10/11，FGA/B和G，而这些早已经在被报道与斑块的形成有关。进一步的，我们发现上调的肌球蛋白重链MYH8，一种在动脉粥样斑块中很少被特征化的蛋白。由于它相关的形式MYH10和MYH8，近期被发现作为一种动脉粥样硬化斑块形成的标志物，我们的发现MYH8在CAD的环境下是鼓舞人心的和具有进一步研究的价值。我们也观察到glyoxalase（GLO）2.5倍的增加，一个普遍细胞酶参与甲基乙二醛的解毒过程，是糖酵解的副产物。大规模的荟萃分析发现涉及抗原提呈过程的基因与CAD过程强相关。关键驱动这个网络的包括GLO1，其能加强这个蛋白在动脉粥样斑块形成过程中作用。我们也观察到了碳酸酐酶CA6约2.3倍的升高，它在血管的钙化过程中具有重要的作用，加速斑块的形成，之前没有和CAD过程有联系，CA同工酶之前人类血管的钙化。我们进一步的发现近期发现的肌动蛋白重链家族（MYH10/11）的扰动是在晚期的动脉粥样硬化斑块中很少被确认的形式，此外作者观察到MACROH2A.1组蛋白表达的一个显著的降低，它在调节自噬和胆固醇流出的过程中很少被研究到。
讨论部分

本文中欧哲通过开发和应用DISCO-MS技术来用于蛋白组学分析晓得组织区域和大样本的全景成像，通过使用AI技术在硅芯片中进行3D重构，运用该项技术作者分析鉴定了年轻小鼠脑早期Aβ淀粉变性斑，蛋白组学的数据为早期AD的干预和诊断治疗提供了理论借鉴。进一步的研究表明在5xFAD的小鼠中时间线和分子细节存在一些差异。作者使用了3xTg AD的小鼠模型，我们的方法也允许分析人尸检样本去探索临床相关性。早期研究表明从全鼠脑的AD裂解液中测绘了蛋白质组学情况，提供仅仅平均信息关于淀粉样斑块而没有特殊的斑块去向。此外，这些研究中的一些仅仅在某些分离的细胞类型或者脑部节段的，再次错过了全器官水平的空间环境。近期，有些研究试图去鉴别5xFAD鼠全脑的淀粉斑。相比之下，我们获得了分离的单个淀粉斑微环境的蛋白组学数据，带有已知的全脑的空间位置信息，因此，我们提供了关于单个斑块的分子信息和他们空间定位的信息，这对于空间靶向治疗非常重要。
尽管组织透明化可能移除一些膜蛋白油脂，我们观察到了致密蛋白GO的分类，几乎很难受到影响，表明DISCO-MS技术能够被用于鉴定药物靶点的表面marker。除了神经科学，该技术也可以将空间分子信息转化成其他生物医学的研究领域和临床样本，作者已经DISCO-MS技术应用到了具有动脉粥样硬化斑块的人类心脏样本，并且鉴别了涉及CAD过程的分子，如GLO1和CA6，MYH6等。
此外最重要的一点是作者研发了机器人手来取样，呈现了一套空间蛋白组学无偏倚的技术去重构全器官的完整的3D成像数据，使得对于目标区域ROI无偏倚的鉴别和自动取样成为可能。