R语言limma包差异表达分析

目录

一、数据准备

1.数据加载

2.做分组信息数据

3.表达数据样本ID顺序与样本信息数据匹配

二、数据预处理

(1)缺失值处理

(2)离群值处理

(3)数据归一化

三、数据探索

(1)查看数据是否经过了log2转换

(2)查看管家基因的表达量

(3)画箱线图查看数据分布

(4)PCA图、层次聚类图

四、差异表达分析

(1)数据准备

(2)差异分析及可视化

(3)提取差异表达基因

---

---

一、数据准备

1.数据加载

#数据表达数据加载
exp1=read.csv('F:\\bioinformatics\\research program\\materialXXXXXXXXXX\\20221101XXXXXXXXXX\\datafile\\GSE5281\\GSE5281traned.csv')

dim(exp1)  #查看数据维度

[1] 20857   162

#加载样本信息数据
sample_info=read.csv('F:\\bioinformatics\\research program\\materialXXXXXXXXXX\\20221101XXXXXXXXXX\\datafile\\GSE5281\\GSE5281 sample.csv')
dim(sample_info)  #查看数据维度

[1] 161  12

2.做分组信息数据

提取样本数据关键信息（分组信息）

sample_data=sample_info[,c(1,2)]  #提取样本信息数据的关键数据
head(sample_data) #查看数据

 Accession         Title
1 GSM238763 EC_affected_1
2 GSM238790 EC_affected_2
3 GSM238791 EC_affected_3
4 GSM238792 EC_affected_4
5 GSM238793 EC_affected_5
6 GSM238794 EC_affected_6

新建修改过的样本分组列

sample_data1=sample_data
sample_data1$group_list=c(rep('AD',87),rep('Control',74))
head(sample_data1)  #查看数据

 Accession         Title group_list
1 GSM238763 EC_affected_1         AD
2 GSM238790 EC_affected_2         AD
3 GSM238791 EC_affected_3         AD
4 GSM238792 EC_affected_4         AD
5 GSM238793 EC_affected_5         AD
6 GSM238794 EC_affected_6         AD

删除第二列

sample_info1=sample_data1[,-2]  #删除第二列
head(sample_info1)  #得到分组信息

 Accession group_list
1 GSM238763         AD
2 GSM238790         AD
3 GSM238791         AD
4 GSM238792         AD
5 GSM238793         AD
6 GSM238794         AD

查看两个数据长度

length(colnames(exp1))  #表达数据的列数，多了一列gene symbol ID
length(sample_info1[,1])  #样本分组类型的长度

[1] 162
[1] 161

3.表达数据样本ID顺序与样本信息数据匹配

表达数据中的列名样本ID号是长成这样的：

colnames(exp1)[2]  #随便看一一个

[1] "X.GSM119615."

为了匹配，需要先修改一下

list1<-list()   #新建一个空列表
cols=colnames(exp1[,2:ncol(exp1)])  #提取表达数据的所有样本ID
cols[2]  #确认字符串样式

[1] "X.GSM119616."

循环语句进行修改

for (i in c(1:length(cols))) {
  list1[i]=substr(cols[i],3,11)
}
head(list1)  #查看数据

[[1]]
[1] "GSM119615"

[[2]]
[1] "GSM119616"

[[3]]
[1] "GSM119617"

[[4]]
[1] "GSM119618"

[[5]]
[1] "GSM119619"

[[6]]
[1] "GSM119620"

替换修改后的样本ID

exp2=exp1
names(exp2)[2:ncol(exp1)]<-list1  #修改列名

查看数据

head(colnames(exp2))
head(sample_info1[,1])

[1] "symbol"    "GSM119615" "GSM119616" "GSM119617" "GSM119618"
[6] "GSM119619"


[1] "GSM238763" "GSM238790" "GSM238791" "GSM238792" "GSM238793"
[6] "GSM238794"

确认两个集合相等

#样本ID比对
FT=colnames(exp2[,2:ncol(exp2)]) %in% list1
a=0
for (j in FT) {
  if (j==TRUE) {
    a=a+0
  }
  else if (j==FALSE) {
    a=a+1
  }
}
a  #a=0说明样本对应没有问题

解决顺序的问题

###修改样本对应顺序，让两个数据的样本数据一致
sample_info2=sample_info1[match(list1,sample_info1$Accession),]
head(sample_info2 )  #现在两个数据的样本信息数据就一致啦

 Accession group_list
88 GSM119615    Control
89 GSM119616    Control
90 GSM119617    Control
91 GSM119618    Control
92 GSM119619    Control
93 GSM119620    Control

二、数据预处理

(1)缺失值处理

dim(exp2)
sum(is.na(exp2))  #没有数据缺失

##若有数据缺失，直接过滤就行
#new_data=na.omit(exp2)

(2)离群值处理

#数据离群处理
#处理极端值
#定义向量极端值处理函数
dljdz=function(x) {
  DOWNB=quantile(x,0.25)-1.5*(quantile(x,0.75)-quantile(x,0.25))
  UPB=quantile(x,0.75)+1.5*(quantile(x,0.75)-quantile(x,0.25))
  x[which(xUPB)]=quantile(x,0.5)
  return(x)
}

head(names(exp2))
#第一列设置为行名
exp3=exp2
rownames(exp3)=exp2[,1]
exp4=exp3[,-1]
head(exp4)
#处理离群值
exp5=apply(exp4,2,dljdz)

(3)数据归一化

#数据归一化
library(limma)
exp6=normalizeBetweenArrays(exp5)

三、数据探索

(1)查看数据是否经过了log2转换

head(exp6)  #发现数据并未经过对数转换

发现数据很大，并未经过log2对数转换

exp7=data.frame(exp6)
#做对数转换
exp8=mutate_if(exp7,is.numeric,funs(log2))  #对数据做对数转换
head(exp8)
head(exp7)

[1] 20857   161
[1] 20857   161

(2)查看管家基因的表达量

#1管家基因的表达量
exp8['GAPDH',]   #挺高的：GAPDH

exp8['ACTB',]   #也挺高的：ACTB

(3)画箱线图查看数据分布

画图数据准备

################画出各种图看看
library(reshape2)
exp8_L=melt(exp8)  #宽数据转为长数据
head(exp8_L)
dim(exp8_L)

names(exp8_L)[1]='sampleID'  #修改列名
head(exp8_L) #查看数据

####将分组信息加入长数据
library(stringr)

str_detect(sample_info2$group_list,'Control')

g_list=ifelse(str_detect(sample_info2$group_list,'Control')==TRUE,'Control','AD')
length(g_list)
head(g_list)  #看看g_list是个什么东西？

exp8_L$group=rep(g_list,each=nrow(exp8))
head(exp8_L)  #查看数据
dim(exp8_L)  #查看数据维度

##加入分组信息到长数据中完毕

画箱线图查看数据分布情况

###接下用ggplot2画图
library(ggplot2)
p=ggplot(exp8_L,
         aes(x=sampleID,y=value,fill=group))+geom_boxplot()  #fill参数：用分组进行颜色映射
print(p)

GSE5281箱线图

上面的图还可以进一步精修

##箱线图精修版
p00=ggplot(exp8_L,
           aes(x=sampleID,y=value,fill=group))+geom_boxplot()  #fill参数：用分组进行颜色映射
#去除网格线和背景
p00=p00+theme_bw()+theme(panel.grid.major = element_blank(),
                         panel.grid.minor = element_blank(),
                         panel.background = element_blank(),
                         axis.line = element_line(colour = 'black'))
p00  #查看图形

GSE5281箱线图（精修版）

(4)PCA图、层次聚类图

层次聚类图

#层次聚类图
sample_info2
exp9=exp8
colnames(exp9)=paste(sample_info2$group_list,1:ncol(exp8),sep = '')
head(exp9)

#定义nodePar
nodePar=list(lab.cex=0.6,pch=c(NA,19),cex=0.7,col='blue')
#聚类
hc=hclust(dist(t(exp9))) #t()的意思是转置

#绘图
plot(as.dendrogram(hc),nodePar = nodePar,horiz = TRUE)

GSE5281层次聚类图

好像看不出来什么。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。

PCA图

##PCA图
library(ggfortify)
df=as.data.frame(t(exp8))  #转置后就变成了矩阵
dim(df)  #查看数据维度
dim(exp8)

df$groupp=sample_info2$group_list  #加入样本分组信息
autoplot(prcomp(df[,1:ncol(df)-1]),data=df,colour='groupp')  #PCA散点图

GSE5281 PCA散点图

大致是分开了 

四、差异表达分析

(1)数据准备

需要三个数据：表达矩阵已经有啦（exp6）；还有：分组矩阵，差异比较矩阵

分组矩阵

design=model.matrix(~0+factor(sample_info2$group_list))
colnames(design)=levels(factor(sample_info2$group_list))
head(exp6)
row.names(design)=colnames(exp6)
design   #得到分组矩阵：0代表不是，1代表是

          AD Control
GSM119615  0       1
GSM119616  0       1
GSM119617  0       1
GSM119618  0       1
GSM119619  0       1
GSM119620  0       1

差异比较矩阵

##差异比较矩阵
contrast_matrix=makeContrasts(paste0(c('AD','Control'),collapse = '-'),levels = design)
contrast_matrix  #-1和1的意思是Control是用来被比的，AD是用来比的


      Contrasts
Levels    AD-Control
  AD               1
  Control         -1
> 

(2)差异分析及可视化

分三步走：lmFit;eBayes;topTable

step1

#step:lmFit
fit=lmFit(exp8,design)
fit2=contrasts.fit(fit,contrast_matrix)

step2

#step:eBayes
fit3=eBayes(fit2)

step3

step3:topTable
tempoutput=topTable(fit3,coef = 1,n=Inf)
DEG_M=na.omit(tempoutput)  #得到差异分析矩阵，重点看logFC和P值
head(DEG_M)  #查看数据


 logFC   AveExpr        t      P.Value    adj.P.Val        B
NEAT1 3.872485  9.512774 15.17968 4.053906e-33 8.455232e-29 64.36975
MSI2  1.621265  9.321856 12.00464 2.962532e-24 2.779383e-20 44.43212
EPC1  1.476923  9.952469 11.91114 5.412282e-24 2.779383e-20 43.84258
DTNA  1.873689 12.034226 11.90096 5.779352e-24 2.779383e-20 43.77838
AMER2 1.406314 12.314261 11.85761 7.641583e-24 2.779383e-20 43.50512
NAV2  1.329965  9.248507 11.85058 7.995541e-24 2.779383e-20 43.46082

接下来就是将上述结果可视化

热图：选取前40个最显著的基因做热图，查看差异是否真的很显著

library(pheatmap)
f40_gene=head(rownames(DEG_M),40)
f40_subset_matrix=exp6[f40_gene,]
head(f40_subset_matrix)
f40_subset_matrixx=t(scale(t(f40_subset_matrix)))  #数据标准化。。。数据标准化和归一化的区别：平移和压缩
pheatmap(f40_subset_matrixx)   #出图

GSE5281前40个差异基因表达数据热图

 火山图

火山图1，没有显示差异基因

#火山图
colnames(DEG_M)
plot(DEG_M$logFC,-log10(DEG_M$adj.P.Val))  #查看图形

GSE5281火山图

火山图2，显示差异基因

DEG=DEG_M
logFC_cutoff=0.5  #选差异倍数的阈值
logFC_cutoff

####给差异分析矩阵数据中的基因加上标签
DEG$change=as.factor(ifelse(DEG$adj.P.Val<0.05 & abs(DEG$logFC)>logFC_cutoff,
                            ifelse(DEG$logFC>logFC_cutoff,'UP','DOWN'),'NOT'))
head(DEG)  #查看数据

nrow(DEG[DEG$change=='UP',])  #上调基因数量
nrow(DEG[DEG$change=='DOWN',])  #下调基因的数量
dim(DEG)
dim(exp6)

thttile=paste0('GSE',5281,
               '\nCutoff for logFC is ',round(logFC_cutoff,1),
               '\nThe number of up gene is ',nrow(DEG[DEG$change=='UP',]),
               '\nThe number of down gene is ',nrow(DEG[DEG$change=='DOWN',]))
thttile  #查看准备的火山图标题
g=ggplot(data = DEG,aes(x=logFC,y=-log10(adj.P.Val),color=change))+
  geom_point(alpha=0.4,size=1.75)+
  theme_set(theme_set(theme_bw(base_size = 20)))+
  xlab('log2 fold change')+ylab('-log10 adj.P.Val')+
  theme_bw()+theme(panel.grid.major = element_blank(),
                   panel.grid.minor = element_blank(),
                   panel.background = element_blank(),
                   axis.line = element_line(colour = 'black'))+
  ggtitle(thttile)+theme(plot.title = element_text(size = 15,hjust = 0.5))+
  scale_color_manual(values = c('blue','black','red'))
print(g)  #输出火山图

GSE5281差异分析火山图

(3)提取差异表达基因

head(DEG)
rownames(DEG[DEG$change=='UP' | DEG$change=='DOWN',])
DEG_MATRIX=exp8[row.names(exp8) %in% rownames(DEG[DEG$change=='UP' | DEG$change=='DOWN',]),]
dim(DEG_MATRIX)  #差异表达基因表达数据

UP_DEG=exp8[row.names(exp8) %in% rownames(DEG[DEG$change=='UP',]),]
dim(UP_DEG)  #上调基因表达数据

DOWN_DEG=exp8[row.names(exp8) %in% rownames(DEG[DEG$change=='DOWN',]),]
dim(DOWN_DEG)  #下调基因表达数据

write.csv(DEG_MATRIX,
          'F:\\bioinformatics\\research program\\materialXXXXXXXXXX\\20221101XXXXXXXXXX\\datafile\\GSE5281\\DEG_MATRIXGSE5281.csv')
write.csv(UP_DEG,
          'F:\\bioinformatics\\research program\\materialXXXXXXXXXX\\20221101XXXXXXXXXX\\datafile\\GSE5281\\UP_DEGGSE5281.csv')
write.csv(DOWN_DEG,
          'F:\\bioinformatics\\research program\\materialXXXXXXXXXX\\20221101XXXXXXXXXX\\datafile\\GSE5281\\DOWN_DEGGSE5281.csv')

好啦，就到这里，欢迎点进来的同学交流和学习！