研究：克隆干扰影响下软清扫的消失

本文翻译自文献 Synchronous Waves of Failed Soft Sweeps in the Laboratory: Remarkably Rampant Clonal Interference of Alleles at a Single Locus（Ming-Chun Lee, Christopher J Marx, Genetics, 1 March 2013, https://doi.org/10.1534/genetics.112.148502）

名词解释

1. 克隆干扰（clonal interference）：也称为 多突变效应（multiple mutation effects），指相比于有性繁殖群体，发生在无性繁殖（“克隆”）群体中的有益突变往往需要更长时间才能被固定的现象。克隆干扰也存在于有性繁殖群体的连锁不平衡区间的生物。如群体中有两个有益突变 A、B，因为不存在重组，所以个体中不可能同时存在 A、B。携带 A 的个体和携带 B 的个体将始终处于竞争状态，直到某突变被淘汰为止。假设 A、B 效应相同，那么 A、B 之间的频率变化类似中性突变频谱。
2. 希尔-罗伯逊效应（Hill–Robertson effect/interference）：指重组可以促进群体的演化。假设基因 a、b 的有益突变分别为 A、B，重组会导致同时携带 A、B（基因型 AB）的个体出现。不考虑上位性影响，基因型 AB 的个体将比 aB 或 Ab 个体具有更大的选择优势。如果没有重组，则只有在后一种突变（B）恰好发生在 Ab 个体中时，才会出现 AB 个体，群体从 A 出现到固定 AB 所需的时间要大大增加。因此，重组可以促进群体的演化。

理论基础

一般认为，如果 突变 $a$ 产生的 基因型 $A$ 的 适应性 $Fi{t}_a$ 大于群体中所有个体的 平均适应性 $Fi{t}_M$，则突变是有益突变，在选择压力下频率会 不断上升。在上升的过程中，群体的平均适应性也在提高，平均适应性 $Fi{t}_M$ 与基因型 $A$ 的适应性 $Fi{t}_a$ 不断接近，基因型 $A$ 的优势不断减小。由于群体是在不断演化的，假设 新突变 $b$ 产生的 新基因型 $B$ 的适应性高于 $A$ 。在没有重组的情况下，群体的平均适应性 $Fi{t}_M$ 会随着基因型 $B$ 的增加进一步升高，当 $Fi{t}_M$ 超过 $Fi{t}_a$ 时，基因型 $A$ 就变成了有害突变，在选择压力下频率 不断下降。如图 1 所示，红色表示有益突变，蓝色表示群体平均适应性。

所以在不断演化的无性繁殖群体中，有益突变的基因型频率会出现 先升后降 的趋势，当频率达到 峰值 时，此时 群体平均适应性约等于基因型的适应性。先前的实验中，研究者只能跟踪观察一个等位基因的变化情况，本实验跟踪观察了多个等位基因在群体中的频率变化，验证在克隆干扰下有益等位基因型会随着更有益突变的出现而被淘汰。

突变材料

实验所使用的是甲醛氧化的天然途径被敲除了，并被来自远缘物种的外来途径所取代的菌株。外源途径储存在质粒 pCM410 上，可以复制但不能结合到核 DNA 中。甲醛氧化天然途经敲除的菌株无法在甲醇作为唯一碳原的培养基上生长，但导入了储存外源途经的质粒后，菌株恢复了在甲醇上生长的能力，但生长速度比野生型慢三倍。

后续的研究发现，质粒 p2META 与 质粒 pCM410 会整合称为新的大质粒（图 2a）。整合后驱动 pCM410 质粒复制的基因 —— trfA 基因会被打断，整个质粒的复制依赖于 p2META 的复制机制，而 p2META 的复制速度慢于 pCM410，即整合减少了质粒 pCM410 在宿主中的拷贝数。研究人员发现，这种整合可以通过降低 pCM410 在宿主中的过度复制与表达而使宿主受益，即突变是有益突变。研究总共发现了 6 种插入方式，都集中在 trfA 基因的 835 和 1103 位点之间。虽然整合的位点不同，但机理都是破坏了 trfA 基因，即这些突变是 等效的、相互之间 存在克隆干扰的 有益突变，为研究 克隆干扰对软清扫的影响 提供了机会。

实验内容

在 8 个重复种群（命名为 F1-F8）中进行实验。每 4 天，将 150 μl 培养物转移到 9.45 ml 含有 15 mM 甲醇的新鲜培养基中（加入培养物后是 9.6ml，15mm 甲醇是 1/64 稀释，最终种群大小为 $1–2\times 10^9$）。300 代后，认为群体已经基本适应培养基，此时生长速度已经较快，转移的时间减少到 2 天。

作者使用 PCR 扩增，检测扩增出片段的分子量的方式判断群体包含的基因型。如图 2b 中，展示了 F7 群体不同代中包含的基因型。其中 L、S12、R1、S11 分别是引物，L/S12 与 R1/S11 是一组应当同时被检测到的扩增产物，一组中两个产物片段和应约等于 1500bp。图中红色、蓝色箭头分别标注了两种基因型，可以看出，红色 基因型随着群体代数的增加，含量不断上升，而 蓝色 基因型在 150 代时条带颜色最深，含量先升后降。

PS：PCR 检测的目的不是不同插入的扩增产物之间的绝对值，而是等位基因的时间动态。

作者用上述 PCR 的方法检测了 8 个重复群体 23 个时间点的冷冻样品的基因型频率，跟踪了突变的动态（图 3）。在 8 个群体中总共发现了 98 个整合事件，其中只有 3 个突变在群体中固定（F1、F7、F8），绝大多数突变都被淘汰了。图中 F5、F6 群体中等位基因频率的双峰轨迹，可能是转移时间改变（4d -> 2d）所引起的。

通过测定培养基的透光率，作者使用群体的增长率来代表群体的适应度（图 4）。图中可以看出：1. 不同群体的增长率有差异，可能不同的群体选择了不同的进化路线；2. 随着代数的增加，增长率不断升高，增长速率不断降低，群体适应性不断提高。

最后，作者统计了 98 种整合在不同群体中的出现时间（图 5）。图中显示出整合的出现具有较高的聚集性，并且不同群体中出现的时间不一样，如 F1 中整合集中发生在早期，而 F2 中则集中发生在晚期。结合图 4 说明群体中也存在这大量其他类型的有益突变。

总结

本研究巧妙的利用实验材料和测量手法，动态观察了有益等位基因在无性繁殖群体中的克隆干扰现象，证明了在新的更适突变出现后，会逐渐淘汰先前的各种有益突变，对区间进行 ”清扫“。之前发生过得各种竞争（如软清扫）都会因为新突变的清扫而不再留下 ”痕迹“。

但实验也有许多问题没有解决：

1. 为何整合的发生具有集中性，整合事件的前提条件是什么？
2. 从突变发生的时间点（图 5）来看，整合事件可以发生在任何时间。那么替换整合事件的新突变也可能发生在整合之前，而让整合的出现作为有害突变。但 8 个群体中都没有出现这个现象，是否整合时间是新突变的先决条件？
3. 作者根据理论来假设是新突变的出现导致群体内多种整合突变开始逐渐被淘汰，但没有明确突变是什么，假设的可靠性存在疑问。