GO和KEGG富集分析详细步骤

GO和KEGG富集分析

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1. 将差异表达结果的基因名称转化为id

因为GO和KEGG分析需要用到id，所以这一步需要将基因名字转换为id。具体步骤如下：

1. 新建空白文件夹，将差异分析得到的diff.xls复制粘贴到文件夹中

2. 因为在这里只需要diff.xls中的基因名称和logFC两列，所以只复制这两列粘贴到新建的文本文件symbol.txt，如下图所示：
   

3. 新建R语言脚本文件symbol2id.R，代码如下：

   if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
       install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("org.Hs.eg.db")
   
   
   setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\cptac\\4_name2id")          #设置工作目录
   
   library("org.Hs.eg.db")          #引用包
   rt=read.table("symbol.txt",sep="\t",check.names=F,header=T)    #读取文件
   genes=as.vector(rt[,1])
   entrezIDs <- mget(genes, org.Hs.egSYMBOL2EG, ifnotfound=NA)    #找出基因对应的id
   entrezIDs <- as.character(entrezIDs)
   out=cbind(rt,entrezID=entrezIDs)
   write.table(out,file="id.txt",sep="\t",quote=F,row.names=F) 
   

4. 设置好工作目录之后，打开R软件，运行上述代码即可。运行结束在文件夹中会有id.txt，打开后如下图所示：
   

   可以看到后面已经有了id这一列了，至此本步骤结束。

2. GO富集分析

GO(gene ontology)是基因本体联合会(Gene Onotology Consortium)所建立的数据库，旨在建立一个适用于各种物种的、对基因和蛋白质功能进行限定和描述的、并能随着研究不断深入而更新的语言词汇标准。GO是多种生物本体语言中的一种，提供了三层结构的系统定义方式，用于描述基因产物的功能。在转录组项目中，GO功能分析一方面给出差异表达转录本的GO功能分类注释；另一方面给出差异表达转录本的GO功能显著性富集分析。

下面介绍GO分析的步骤：

1. 将含有基因id的文本文件id.txt复制粘贴到新的文件夹中

2. 新建R语言脚本，命名为GO.R，其代码如下：

   install.packages("colorspace")
   install.packages("stringi")
   install.packages("ggplot2")
   
   if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
       install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("DOSE")
   
   if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
       install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("clusterProfiler")
   
   if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
       install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("enrichplot")
   
   library("clusterProfiler")
   library("org.Hs.eg.db")
   library("enrichplot")
   library("ggplot2")
   
   setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\cptac\\5_GO分析")                  #设置工作目录
   rt=read.table("id.txt",sep="\t",header=T,check.names=F)           #读取id.txt文件
   rt=rt[is.na(rt[,"entrezID"])==F,]                                 #去除基因id为NA的基因
   gene=rt$entrezID
   
   #GO富集分析
   kk <- enrichGO(gene = gene,
                  OrgDb = org.Hs.eg.db, 
                  pvalueCutoff =0.05, 
                  qvalueCutoff = 0.05,
                  ont="all",
                  readable =T)
   write.table(kk,file="GO.txt",sep="\t",quote=F,row.names = F)                 #保存富集结果
   
   #柱状图
   pdf(file="barplot.pdf",width = 10,height = 8)
   barplot(kk, drop = TRUE, showCategory =10,split="ONTOLOGY") + facet_grid(ONTOLOGY~., scale='free')
   dev.off()
   
   #气泡图
   pdf(file="bubble.pdf",width = 10,height = 8)
   dotplot(kk,showCategory = 10,split="ONTOLOGY",orderBy = "GeneRatio") + facet_grid(ONTOLOGY~., scale='free')
   dev.off()
   

   这里GO分析用到的包为"clusterProfiler"，画图用到的包为"enrichplot"。在代码中会设置p值和q值，设置的都是0.05，如果该条件下分析得到的可用基因较少，可将q设置为0，只看p值，但这样准确性也会降低一些。

3. 打开R软件，运行上述代码，最终得到的结果如下图所示，下图按顺序分别是柱状图、气泡图以及GO分析结果。
   
   
   

4. 讲一下GO分析得到的文本文件，也就是上面三幅图中的最后一幅图，第一列是GO分析的分类，分别是BP，CC，MF；第二列是GO的id；第三列为对应的描述；第四列为基因背景的比例；第五列为p值，表示富集的显著性；第六列为p值得校正值；第七列为q值；第八列为基因id，也就是基因名称；最后一列就是富集在每个GO上的数目。对于柱状图和气泡图，会分为BP，CC，MF，每个类别颜色越红表示富集程度越高。

3. GO圈图绘制

话不多说，直接上步骤。

1. 新建R语言脚本文件GOplot.R，脚本文件和GO分析得到的结果放在同一目录下，其代码如下：

   install.packages("digest")
   install.packages("GOplot")
   
   library(GOplot)
   setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\cptac\\6_GO圈图绘制")              #设置工作目录
   
   ego=read.table("GO.txt", header = T,sep="\t",check.names=F)      #读取kegg富集结果文件
   go=data.frame(Category = "All",ID = ego$ID,Term = ego$Description, Genes = gsub("/", ", ", ego$geneID), adj_pval = ego$p.adjust)
   
   #读取基因的logFC文件
   id.fc <- read.table("id.txt", header = T,sep="\t",check.names=F)
   genelist <- data.frame(ID = id.fc$gene, logFC = id.fc$logFC)
   row.names(genelist)=genelist[,1]
   
   circ <- circle_dat(go, genelist)
   termNum = 5                                     #限定term数目
   geneNum = nrow(genelist)                        #限定蛋白数目
   
   chord <- chord_dat(circ, genelist[1:geneNum,], go$Term[1:termNum])
   pdf(file="circ.pdf",width = 11,height = 10.5)
   GOChord(chord, 
           space = 0.001,           #基因之间的间距
           gene.order = 'logFC',    #按照logFC值对基因排序
           gene.space = 0.25,       #基因名跟圆圈的相对距离
           gene.size = 4,           #基因名字体大小 
           border.size = 0.1,       #线条粗细
           process.label = 7.5)     #term字体大小
   dev.off()
   
   termCol <- c("#223D6C","#D20A13","#FFD121","#088247","#58CDD9","#7A142C","#5D90BA","#431A3D","#91612D","#6E568C","#E0367A","#D8D155","#64495D","#7CC767")
   pdf(file="cluster.pdf",width = 11.5,height = 9)
   GOCluster(circ.gsym, 
             go$Term[1:termNum], 
             lfc.space = 0.2,                   #倍数跟树间的空隙大小
             lfc.width = 1,                     #变化倍数的圆圈宽度
             term.col = termCol[1:termNum],     #自定义term的颜色
             term.space = 0.2,                  #倍数跟term间的空隙大小
             term.width = 1)                    #富集term的圆圈宽度
   dev.off()          
   

2. 打开R软件运行上述代码即可。最终即可得到两个圈图，如下图所示：
   

   左半圆圈为基因名字，从下到上按照logFC进行排序得，圆圈右半部分为GO的名称，基因与GO之间得连线表示这个基因存在于该GO上。
   

   此图为聚类图，内部圆圈为基因或蛋白，颜色表示logFC的大小，内部的一个扇形表示一个基因，如果内部的一个扇形对应着外部的一个颜色的扇形，那么表示该基因只存在于这一个颜色对应的GO里面；如果内部一个扇形对应着外部三个扇形，那么表示内部的这个基因存在于三个GO里面。

4. KEGG富集分析

1. 将差异分析得到的含有id的id.txt文件作为输入文件，新建文件夹，将id.txt拷贝到此文件夹下

2. 新建R语言脚本文件，更改脚本文件的环境目录，代码如下：

   install.packages("colorspace")
   install.packages("stringi")
   install.packages("ggplot2")
   
   if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
       install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("DOSE")
   
   if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
       install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("clusterProfiler")
   
   if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
       install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("enrichplot")
   
   
   library("clusterProfiler")
   library("org.Hs.eg.db")
   library("enrichplot")
   library("ggplot2")
   
   setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\cptac\\7_KEGG分析")            #设置工作目录
   rt=read.table("id.txt",sep="\t",header=T,check.names=F)       #读取id.txt文件
   rt=rt[is.na(rt[,"entrezID"])==F,]                             #去除基因id为NA的基因
   gene=rt$entrezID
   
   #kegg富集分析
   kk <- enrichKEGG(gene = gene, organism = "hsa", pvalueCutoff =0.05, qvalueCutoff =2)      #富集分析
   write.table(kk,file="KEGGId.txt",sep="\t",quote=F,row.names = F)                          #保存富集结果
   
   #柱状图
   pdf(file="barplot.pdf",width = 10,height = 7)
   barplot(kk, drop = TRUE, showCategory = 30)
   dev.off()
   
   #气泡图
   pdf(file="bubble.pdf",width = 10,height = 7)
   dotplot(kk, showCategory = 30,orderBy = "GeneRatio")
   dev.off()
   

3. 打开R软件运行上述代码，即可得到结果。
   
   

   KEGG因为数据库更新比较慢，而且分析时需要联网，因此富集到结果就会比较少。

4. 运行完之后还会得到KEGGId.txt，里面的需要将里面的id转化为基因名字。因此新建perl脚本文件，代码太长，这里就不展示了。在该文件夹目录下打开powershell窗口，输入命令perl id2symbol.pl，运行完毕之后文件夹目录下就会产生新的含有基因名字的kegg文件，文件名为kegg.txt

5. 至此，KEGG分析完毕

5. KEGG圈图绘制

这里的圈图绘制和上面的GO圈图绘制步骤一样的。话不多说，直接上代码：

install.packages("digest")
install.packages("GOplot")

library(GOplot)
setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\cptac\\8_KEGG圈图绘制")              #设置工作目录

ego=read.table("kegg.txt", header = T,sep="\t",check.names=F)       #读取kegg富集结果文件
go=data.frame(Category = "All",ID = ego$ID,Term = ego$Description, Genes = gsub("/", ", ", ego$geneID), adj_pval = ego$p.adjust)

#读取基因的logFC文件
id.fc <- read.table("id.txt", header = T,sep="\t",check.names=F)
genelist <- data.frame(ID = id.fc$gene, logFC = id.fc$logFC)
row.names(genelist)=genelist[,1]

circ <- circle_dat(go, genelist)
termNum = 2                                     #限定term数目
geneNum = nrow(genelist)                        #限定基因数目

chord <- chord_dat(circ, genelist[1:geneNum,], go$Term[1:termNum])
pdf(file="circ.pdf",width = 10,height = 9.6)
GOChord(chord, 
        space = 0.001,           #基因之间的间距
        gene.order = 'logFC',    #按照logFC值对基因排序
        gene.space = 0.25,       #基因名跟圆圈的相对距离
        gene.size = 4,           #基因名字体大小 
        border.size = 0.1,       #线条粗细
        process.label = 7.5)     #term字体大小
dev.off()

termCol <- c("#223D6C","#D20A13","#FFD121","#088247","#58CDD9","#7A142C","#5D90BA","#431A3D","#91612D","#6E568C","#E0367A","#D8D155","#64495D","#7CC767")
pdf(file="cluster.pdf",width = 10,height = 9.6)
GOCluster(circ.gsym, 
          go$Term[1:termNum], 
          lfc.space = 0.2,                   #倍数跟树间的空隙大小
          lfc.width = 1,                     #变化倍数的圆圈宽度
          term.col = termCol[1:termNum],     #自定义term的颜色
          term.space = 0.2,                  #倍数跟term间的空隙大小
          term.width = 1)                    #富集term的圆圈宽度
dev.off()

这里将代码的工作环境更改一下，然后将kegg分析所得到的kegg.txt和之前的id.txt复制到同一目录下，然后打开R软件运行代码即可。得到的圈图如下：

至此，KEGG圈图绘制结束。