胚胎期造血的特异性骨髓微环境

文章信息

文章题目：A specialized bone marrow microenvironment for fetal haematopoiesis
期刊：Nature Communications
日期：2022年3月14日
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-28775-x

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文章报道了胚胎期骨髓微环境与成年骨髓微环境的差别，揭示了胚胎骨动脉在造血干细胞首次进入胚胎骨髓过程中的重要性。

摘要

本文中研究人员利用遗传操作小鼠通过单细胞测序对比分析发现，造血干细胞和骨髓微环境在胚胎期与成年期差异巨大，动脉血管在胚胎骨髓中具有重要。在小鼠胚胎发育第16.5天，绝大多数造血干/祖细胞都位于动脉血管旁。虽然胎儿股骨基本上缺乏瘦素受体表达细胞，但动脉内皮细胞（AEC）提供Wnt配体来控制最初的HSPC扩张。研究人员发现此时的骨髓动脉可以释放Wnt2，动脉来源的Wnt信号影响造血干/祖细胞的扩增。而利用重组蛋白Wnt2在体外处理造血干/祖细胞，可以促进造血干/祖细胞的增殖、增强造血干/祖细胞形成体外克隆的能力。而当AEC分泌Wnt被基因阻断时，造血干/祖细胞减少。综上，该研究揭示了胚胎和成年生物体中骨髓微环境的细胞组织和分子调节的根本性转变，未来或有助于提高造血干细胞移植效率。

引言

造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSC）是一种生物体内稀有细胞类群，具有自我更新能力和多能分化潜能的特性，它们共同维持造血系统中所有细胞类型的生成。目前治疗多种恶性血液疾病的普遍方法就是采用放化疗后进行造血干细胞移植，重建血液系统。因此对造血干细胞植入骨髓机制的研究，有助于提高造血干细胞移植效率。在成年哺乳动物体内，造血干细胞主要存在于骨髓中。造血干细胞的维持、静息和增殖等行为受到其微环境的调控。成年动物骨髓中造血干细胞和骨髓微环境的相互作用，已被较深入研究。但胚胎期骨髓微环境如何调控造血干细胞的行为仍不清楚。在最新研究中发现，造血干细胞发育过程中，动脉血管调控造血干细胞首次进入胚胎期骨髓。在本研究中，作者结合scRNA-seq、流式细胞术、高级成像、组织特异性遗传小鼠模型和BM移植实验来研究胎儿股骨基质细胞和HSPCs之间的相互作用。这揭示了胎儿BM与成人BM在细胞组成和HSPC调控方面有根本的不同。基于本研究结果，作者认为正在发育的骨髓中的动脉内皮细胞提供了促进胚胎骨新生定植的关键信号。

结果

1、胎儿BM中血管和HSPC的发育

为了了解胚胎HSPCs和骨髓微环境细胞的特性和异质性，研究者首先对胚胎期骨髓血管和c-Kit+造血干/祖细胞的发育进行分析。发现骨髓血管最早在胚胎发育E15.0至E15.5形成于第一骨化中心，在形成初期的E15.5就已完成初步的动静脉分化，出现了CD31+ Emcn-的动脉血管。但此时的骨动脉血管尚未完全成熟，未被血管平滑肌细胞包裹。而在E16.5之前，无法在胚胎骨髓中检测到c-Kit+造血干/祖细胞。这表明血管进入骨髓和完成动静脉分化的发育时间，先于c-Kit+造血干/祖细胞进入骨髓的时间。

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图1：胚胎和成人BM成分的比较分析

• a-c c-Kit+造血细胞在E16.5的BM中比较少，在之后的胚胎发育（E17.5（b），E18.5（c））中迅速增加。c-Kit（绿色）；CD31（红色）; 细胞核, DAPI（蓝色）。
• d,e UMAP图展示在去除Lin+细胞后，胚胎（E18.5）和成年小鼠股骨BM细胞的分群以及两者之间的差异。
• g 条形图展示每个亚群的细胞所占比例。右侧图表是各群细胞数量。
• h 用差异基因表达分析（DEGs）比较E18.5和成年小鼠HSPCs的每个亚群。
• i 小提琴图展示E18.5和成年小鼠各亚群中介导HSPCs发育的关键转录因子和受体的表达水平。

2、HSPCs与骨髓基质单细胞比较分析

为了比较成年和胚胎HSPCs以及股骨中的基质细胞，作者从成年和E18.5小鼠中分离出BM细胞，进行单细胞测序。结果显示细胞亚群水平的差异表达基因(DEG)分析显示E18.5与成年小鼠HSPCs之间存在显著差异，每个亚簇中有数百个DEG，这与之前的报道一致。这些DEGs包括介导HSPC发育的关键转录因子和受体。

E18.5与成年小鼠最显著的差异可见于骨髓基质细胞室(此处定义为BMSCs)(图2a)。通过细胞亚聚类，我们检测到2组骨鞘细胞(OLCs-1, OLCs-2)、有丝分裂的BMSCs、成体富集的BMSCs (aBMSC)和两组胚胎富集的BMSCs (eBMSC-1, eBMSC-2)(图2a, b)。Lepr + aBMSCs代表了造血干细胞表达Lepr的网状生态位细胞，在成体BMSCs中高度丰富(图2a)，但在E18.5时几乎完全缺失(图2a)。基于此作者提出：胎儿骨髓中的另一个骨髓干细胞群是否具有LepR+ aBMSCs的功能。高表达III型胶原亚基1 (Col3a1high)、蛋白多糖decorin (Dcn)和c型凝集素结构域家族成员Gsn/Clec3b的eBMSC-1群体占胎儿BMSCs的大多数(57%)，但在成人中显著减少。

通过组织切片免疫染色和对转基因小鼠基因标记细胞的FACS分析，证实胎儿几乎不存在BM中LepR+网状细胞。DEGs也表明了胚胎和成年全BMSCs群体的独特分子特性。众所周知，LepR+网状细胞为造血干细胞提供了关键的生态位因子，最显著的是干细胞因子(SCF;由Kitl编码)、趋化因子Cxcl12和生长因子血管生成素-1 (Angpt1)。与E18.5缺乏LepR+亚群的情况一致，所有这些转录本在胚胎期BMSCs中的表达都非常低，这意味着LepR+细胞分泌的这些骨髓龛因子并没有被Col3a1+ eBMSCs所取代。基于此，作者认为小鼠胚胎期的骨髓微环境中几乎不存在LepR+网状细胞。

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图2 ：胚胎和成人骨髓基质细胞的比较分析

• a UMAP图显示E18.5和成年小鼠骨髓基质细胞（BMSCs）的分群。条形图展示了各群细胞所占的百分比，右侧表格是各群细胞的数量。
• b UMAP图显示每个骨髓基质细胞亚群的代表性标记基因的分布。颜色代表基因的表达水平。
• c confocal图展示了成年小鼠或E18.5 R26-mTmG Cre报告小鼠骨髓中Lepr-Cre标记的血管周围细胞数量。Lepr-Cre-controlled GFP主要标记成年小鼠骨髓中的窦状血管相关（网状）细胞，而在E18.5时GFP+细胞很少。
• d 在E18.5和成年小鼠的所有BMSCs细胞之间的DEGs。
• e 小提琴图展示E18.5时或成年时所有BMSCs中关键生态位因子的表达。y轴表示每个基因的表达水平。
• f 每个E18.5和成年BMSC亚群的DEGs。
• g 小提琴图展示在每个E18.5或成年BMSC亚群中HSPC生态位相关基因的表达。

骨ECs的无监督亚聚类显示E18.5和成人中类似的主要亚群(图3a)。两组都包含Emcn低表达、激酶Bmx、转录因子Sox17、跨膜配体ephrin-B2 (Efnb2)、缝隙连接蛋白连接蛋白37 (Gja4)和Caveolin-1 (Cav1)高水平转录的分化aec。在E18.5和成人样本中都存在Stab2high ECs，代表BM的ECs在造血中发挥重要作用(图3a)。在亚群水平上比较胚胎和成体ECs发现了数百个显著的deg(图3c)，而分泌的骨髓龛因子如Kitl、Cxcl12或Pdgfb没有明显的改变(图3d)。作者使用Interactome分析来评估基质细胞和HSPCs中的DEGs是否在转录组水平上指示hspc调控的差异。该分析表明，胚胎骨与成年骨中潜在的HSPCs-微环境中细胞相互作用发生了显著变化(图3e, f)。表明小鼠胚胎骨髓单细胞的结果表明其具有自身的特征，并且与成年骨髓单细胞存在显著差异。

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图3：胚胎和成年内皮细胞的比较分析

• a UMAP图显示E18.5和成年股骨内皮细胞（ECs）的分群。条形图表示每个亚群所占百分比。
• b UMAP图显示每个EC亚群的代表性标记基因的分布。颜色代表基因的表达水平。
• c E18.5和成年小鼠EC亚群的DEGs。
• d E18.5或成年时选出的几个EC来源的HSPC支持因子的表达水平。
• e,f 非造血支持细胞与HSPCs（e）或多潜能HSPCs（f）之间潜在的相互作用（箭头）的互作分析。线条和箭头的宽度代表基因的相对log2差异表达倍数。蓝色箭头表示在成年小鼠中富集的信号；红色箭头表示在E18.5中富集的信号。

3、初始植入的HSPCs和HSCs与AECs相关

接下来，作者探讨了在LepR+网状细胞出现之前，哪些细胞群可能支持胎儿BM中HSPCs的初始植入和增殖。对染色的骨切片分析显示，CD150+ CD48−CD41−Lin−造血干细胞主要与E16.5位点的Caveolin-1+ AECs重合(图4a, b)。据统计，超过65%的HSC群体位于Caveolin-1+ AECs的10 μ m范围内(图4c)，提示动脉可能会影响造血干细胞对胎儿BM的初始定植。更近一步的分析还表明，这些最初植入的造血干细胞优先位于骨干中心。同样，c-Kit+ hspc与cavelin -1+ AECs在E16.5位点紧密对齐(图4 - f)，提示动脉在造血干细胞和造血干细胞定植胎儿BM中发挥作用。对的scRNA-seq数据的深入分析表明，胚胎AECs表达多种作用于HSPCs骨髓龛因子，如Cxcl12、Kitl、Jag1和Jag2、Dll4、Vegfc和Tgfb2，这些已知作用于多能hspc(图4g;i)。相互作用分析进一步支持胎儿AECs和hspc在BM发育过程中的信号相互作用(图4h)。

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图4：动脉与胚胎BM中的初始HSC和HSPC增殖有关

• a 免疫荧光图显示E16.5时Lin-CD48-CD41-CD150+HSC（绿色，箭头）和 Caveolin-1+AEC（红色）的排列情况。蓝色，Lin+CD48+ CD41+。
• b CD150+细胞（绿色）和 Caveolin-1+动脉（红色）的3D重建图像。
• c 在E16.5时，根据3D重建的HSC (N = 48)、Lin+ CD48+ CD41+成熟造血细胞 (N = 2203) 或 DAPI+细胞 (N = 6174) 和 Caveolin-1+ AEC之间的距离量化。P-value，Kolmogorov-Smirnov检验。
• d 在E16.5时，c-Kit+造血细胞（绿色）和Caveolin-1+ AEC（箭头，红色）的排列。CD31，蓝色。
• e c-Kit+造血细胞（绿色）和Caveolin-1（红色）位置的3D重建图像。
• f 在E16.5时，根据3D重建的c-Kit+ (N = 258)、Lin+ CD48+ CD41+成熟造血细胞 (N = 2052)或DAPI+随机细胞(N = 6665)和Caveolin-1+ AEC之间的距离量化。
• g 小提琴图展示在E18.5时，AEC或其他EC亚群中编码血管分泌或HSPC支持因子的标志性基因的表达。
• h 多潜能HSPC和不同EC亚群之间潜在的相互作用（箭头）的互作分析。线条和箭头的宽度代表基因的相对表达水平。

4、AECs衍生的Wnt调节胎儿HSC和HSPCs的发育

scRNA-seq分析也提示Wnt信号通路在胎骨中ECs和HSPCs之间的通信中发挥作用，但在整个转录组数据中几乎检测不到许多Wnt通路组分的表达。因此，我们使用带有预先设计的Wnt通路成分引物的定制面板进行靶向scRNA-seq分析。该分析显示AECs是E18.5 BM中Wnt配体的来源，Wnt2是β-catenin依赖的典型Wnt信号的激活剂，表达最高(图5a)。相互作用分析支持aec来源的Wnt2在E18.5位点对造血细胞的潜在调控(图5b)。通过一系列的实验证明，在胎儿BM发育过程中，AECs是Wnt配体的主要来源。

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图5：胚胎BM中通过Wnt的AEC-HSPC crosstalk

• a 靶向scRNA-seq表达分析显示E18.5和成年小鼠的非动脉或动脉ECs中的不同Wnt配体。点大小表示检测到基因的细胞的百分比，颜色表示每簇中基因的平均表达水平。
• b 在E18.5和成年小鼠BM中潜在的Wnt信号相互作用的互作分析。线条和箭头的宽度代表基因的相对表达水平。
• c 他莫昔芬处理和WlsiΔBmxmice分析的示意图。
• d E18.5WlsiΔBmx突变体和同窝对照中c-Kit+细胞的免疫荧光图。柱状图展示了c-Kit+细胞覆盖面积的量化。Ctrl = 6; WlsiΔBmx= 8。Error bars，mean±s.e.m。P values，双尾非配对t检验。
• e CD45.2/CD45.1 长时程再增殖实验的示意图。来自两个WlsiΔBmx或同窝对照小鼠的股骨的所有细胞都作为CD45.2供体。
• f 长时程竞争性再增殖试验的量化图表展示了供体来源（CD45.2，control=12和WlsiΔBmx = 11）骨髓细胞（CD11b+）、B细胞（B220+）和T细胞（CD4+和CD8+）的百分比。Error bars，mean±s.e.m。P values，双尾非配对t检验。
• g 在E18.5WlsiΔBmx和同窝对照BM中，通过FACS分选出的HSC和LSK细胞数量（Ctrl = 11；WlsiΔBmx=13）标准化后的量化。将绝对细胞数标准化作为对照。Error bars，mean±s.e.m。P values，双尾非配对t检验。
• h 在E18.5WlsiΔBmx（N = 102）和同窝对照小鼠（N = 272）中，基于3D重建的HSC和Caveolin-1+ AEC之间距离的量化。
• i 在E18.5WlsiΔBmx和同窝对照BM中，通过FACS分选出的Lin- c-Kit+(Ctrl = 11; WlsiΔBmx = 13) 和Lin-c-Kit+CD127+、Lin-c-Kit+CD34+、Lin-c-Kit+CD16/32+细胞数量(Ctrl = 7；WlsiΔBmx = 9)。
• j 在E18.5WlsiΔBmx和同窝对照的股骨BM中，通过FACS分选出的Ter119+、CD45+、Gr-1+、B220+、CD4/8+细胞占比的量化。

5、AECs通过β-catenin调节HSPCs增殖

接下来，作者探讨了aec衍生的Wnt信号是否会直接影响HSPC功能。对携带Tcf/Lef:H2B-GFP报告基因等位基因的E18.5胚胎的流式细胞术分析表明，GFP在LSK细胞中表达。同样，scRNA-seq分析揭示了几个Wnt通路基因在HSPCs中的表达。在功能研究中，我们生成了Vav1- cre +/T Ctnnb1lox/lox (Ctnnb1∆Vav1)突变体小鼠，该小鼠的Vav1+造血细胞中的β-catenin功能发生缺失。在E18.5时，Ctnnb1∆Vav1股骨中c-Kit+细胞面积以及HSCs、LSK细胞和其他Lin - c-Kit+ HSPC细胞数量相对对照组减少(图6a - d)。为了避免早期造血发育中的潜在缺陷，并确认β-catenin依赖的Wnt信号在c-Kit+ hspc中的必要性，作者接下来生成了他莫昔芬诱导的(Ctnnb1i∆Kit)小鼠。在E14.5-E17.5中显示股骨c-Kit+面积减少，HSCs、LSK细胞和其他hspc细胞数量减少(图6e-h)。表明hspc的减少不是由CreER敲入c-Kit基因座本身引起的，在没有他莫西芬处理的Ctnnb1i∆Kit胚胎中，HSPCs的数量没有显著改变。这些结果的总和表明，aec控制的Wnt/β-catenin信号通路促进胎儿BM中HSPC的增殖。

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图6 ：AECs通过Wnt和β-catenin调节HSPC增殖

• a 在E18.5Ctnnb1ΔVav1敲除和同窝对照小鼠BM中，c-Kit+细胞覆盖区域的免疫荧光图。
• b c-Kit+细胞覆盖区域的定量（Ctrl = 4；Ctnnb1ΔVav1 = 4）。
• c, d 在E18.5Ctnnb1ΔVav1和同窝对照小鼠中，HSC和LSK细胞(c)和Lin- c-Kit+、Lin- c-Kit+ CD127+、Lin- c-Kit+ CD34+、Lin- c-Kit+ CD16/32+细胞(d)的量化。Ctrl = 7;Ctnnb1ΔVav1= 7。
• e 在E18.5Ctnnb1iΔKit和同窝对照小鼠BM中，c-Kit+细胞覆盖区域的免疫荧光图。
• f c-Kit+细胞覆盖面积的定量。Ctrl = 5; Ctnnb1iΔKit = 4。
• g, h 在E18.5Ctnnb1iΔKit和同窝对照小鼠BM中，基于FACS的HSC和LSK细胞数量(g)以及Lin-c-Kit+、Lin-c-Kit+CD127+、Lin-c-Kit+ CD34+、Lin-c-Kit+CD16/32+细胞(h)的定量。Ctrl = 7; Ctnnb1iΔKit= 8。
• i 用他莫昔芬、EdU处理和分析WlsiΔBmx小鼠的实验示意图，c-Kit+细胞的EdU染色的免疫荧光图，以及c-Kit+细胞中EdU%的量化。Ctrl = 3；WlsiΔBmx = 3。
• j 通过FACS分选出WlsiΔBmx和对照LSK细胞中EdU+细胞。Ctrl=3；WlsiΔBmx=6。
• k 通过FACS分选出Ctnnb1ΔVav1和对照LSK细胞中EdU+细胞。Ctrl = 7; Ctnnb1ΔVav1 = 7。
• l 通过FACS分选出Ctnnb1iΔKit和对照LSK细胞中EdU+细胞。Ctrl = 5; Ctnnb1iΔKit = 4。

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图7：Wnt2促进HSPC增殖和移植

• a FACS图显示用Wnt2处理后的LSK细胞和对照中的瞬时EdU结合率。右侧是LSK细胞中EdU%的量化。Ctrl = 6; Wnt2 = 7。
• b 体外培养8天后，600个分选出的野生型成年小鼠LSK细胞的集落形成单位。菌落计数，vehicle= 10；Wnt2 = 9。细胞总数计数，vehicle= 6；Wnt2 = 5。
• c，d 相对于成年小鼠细胞，造血干细胞数量和LSK数量的差异倍数的量化(c)；vehicle= 10；Wnt2 = 9。以及Wnt2处理后的绝对细胞数(d);vehicle = 15；Wnt2 = 14。
• e Wnt2对体外分选出来的成年Vav1-mTmG LSK细胞的处理，以及移植到辐照后的WT小鼠体内5天后进行分析的示意图。
• f 移植Wnt2、vehicle预处理的GFP+细胞、新鲜细胞5天后，对应的宿主骨切片的免疫染色图。
• g 移植Wnt2、vehicle预处理的GFP+细胞、新鲜细胞5天后，通过FACS分选出来自宿主的GFP+或GFP+CD11b+细胞。
• h 移植后5天,BM中通过FACS得到的GFP+、GFP+CD45+和GFP+CD11b+细胞百分比的定量。input= 5; ctrl = 20; Wnt2 = 15。
• i Wnt2对体外分选出来的成年WT LSK细胞的处理，以及移植到辐照后的WT小鼠体内2周后进行分析的示意图。
• j FACS分选出的 LSK%、SLAM-LSK%（ctrl = 10；Wnt2 = 10）以及 BMNC、Gr-1+骨髓细胞、B220+ B淋巴细胞和CD4/8+T淋巴细胞的数量的量化。ctrl = 14; Wnt2 = 12。

总结与讨论

我们的工作总结提供了一些了解的生物学过程，即HSPCs对胎儿骨的从头定植，这对发育一个功能完整的造血系统至关重要。我们的单细胞转录组分析揭示了胎儿和成人脑转移之间在细胞组成、基因表达和细胞-细胞相互作用方面的实质性差异。LepR+网状细胞，一种与窦状血管相关的基质细胞群，在成年生物中为hspc提供必要的生态位信号，在胎儿骨髓中不存在。这一发现与之前使用免疫染色和FACS研究BMSC发育的文章一致，但我们的scRNA-seq分析表明，LepR+群体的缺失不仅反映了单个基因(即LepR)的表达缺失，而且反映了胎儿BM中BMSC亚群的实际缺失。随着LepR+血管周细胞在出生后2周变得丰富，一种可能是它们的功能在胚胎和出生后早期发育中被另一群血管周间充质细胞接管。我们的研究发现eBMSC-1是胎儿BM中最丰富的血管周细胞群，但这些细胞不延伸明显的网纤维，缺乏主要龛因子的表达，如SCF、Cxcl12或angiopoietin-1。在成年BMSCs中也发现了少量eBMSC-1细胞，但这些细胞只占总BMSCs的一小部分，E18.5位点的eBMSC-1细胞与成年BMSCs在基因表达上存在显著差异。除了LepR+网状细胞外，成人BM基质的其他主要细胞成分已经存在于胎儿中，因此可能支持骨髓的造血定植。

大量研究对成人骨中造血干细胞的微环境进行了研究。有人提出，小动脉小龛维持成年造血干细胞的静息，而其他一些研究将静息的、长期的成年造血干细胞置于窦血管附近，从而形成LepR+网状小龛细胞。虽然本研究结果不排除窦血管、成骨细胞和其他基质细胞群的潜在贡献，但表明，在胎儿骨髓中不存在LepR+网状细胞，而且胚胎造血干细胞和造血干细胞与发育中的股骨动脉相关。动脉在多个层面上参与造血系统的发展。在早期胚胎中，主动脉是通过内皮-造血转化产生决定性造血干细胞的主要部位，在发育后期，小动脉帮助维持胎儿肝脏中的造血干细胞。本研究结果进一步阐明了动脉的作用，表明动脉通过激活hspc中典型的、β-catenin依赖的Wnt信号，促进了胎儿BM的首次造血定植。aec衍生的Wnt增强HSPC的定植和增殖，但是，我们看到E16.5股骨中这些细胞的减少，不应排除在循环、进入或植入胎儿HSPC中的额外作用。除了AECs，其他基质细胞群也可能参与胎儿BM的造血定植，这可能涉及Wnt配体的释放，也可能涉及其他分子信号。

本研究填补了胚胎肝脏造血和出生后成熟骨髓之间造血系统发育的一环。在出生后骨髓中，是什么细胞和分子变化介导造血干细胞从动脉向窦血管转移?eBMSCs的确切性质是什么?这些细胞是否会产生成人BM中发现的其他间充质细胞群?照射和BM移植后，这个过程是否会再次出现?由于辐照条件作用于HSPC移植会导致LepR+细胞的丢失等。因此，胎儿骨髓的发现可能为BM再生开辟新的概念途径。

亮点

小鼠造血干细胞和骨髓微环境的细胞组成和分子相互作用方面在胚胎期与成年期存在显著差异，阐明胚胎期骨髓动脉血管在HSPCs首次进入骨髓中的关键作用。

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