WGS分析笔记（6）—— call CNV 和一些其他

• CNVs（copy number variations）是除了SNVs、INDELs之外另一种可能导致孟德尔遗传疾病的变异类型，指的是大片段（1kb到几个Mb）的碱基出现拷贝数的变异（del、dup等）。

• 目前常用的关于CNVs的数据库有DGV、DECIPHER等，以下链接可供参考。

  • 健康人群 CNV： Genomic Variants www.projects.tcag.ca/variation
  • 神经发育异常的患者 CNVs： DECIPHER www.sanger.ac.uk/PostGenomic/decipher/
  • 染色体异常的患者 CNVs： www.ukcad.org.uk/cocoon/ukcad、www.isca.genetics.emory.edu/
  • 染色体非平衡变异的患者 CNVs： www.ecaruca.net

• 目前临床上对于CNVs的检测一般有CMA、MLPA、CNV-se、aCGH等技术，但是对于WES、WGS的数据也可以使用软件进行call CNVs。

• 目前有很多进行call CNVs的软件，本文主要记录cnvnator的安装和使用。

• cnvnator相关文章发表在2011年的《Genome research》上，而相关的软件也挂在了github上，网址如下：https://github.com/abyzovlab/CNVnator

• cnvnator最大的一个缺点就是安装十分不便，和其他软件相比，这基本上是最被大家吐槽的一点，其次是运行所占内存也是较大的。

• 当然你可以选择现成的docker使用

  $ docker pull diploid/cnvnator
  

• 我这里记录并分享一下我的使用经历包括安装经历。

• 首先是安装

  # 笔者是作为管理员在Root的权限下安装的，可以在个人用户下安装
  # 首先是root的安装，root可以理解为一个软件，也是cnvnator所依赖的
  $ git clone https://github.com/root-project/root.git
  $ mkdir build
  $ cd build
  $ cmake ../root
  $ make -j 4
  $ source bin/thisroot.sh
  # 这里提醒一下，笔者安装过多次root，各种版本的，新的、旧的，无一都失败了，只有上述这个成功了
  # 接下来就是CNVnator的安装，
  $ git clone https://github.com/abyzovlab/CNVnator.git
  $ cd CNVnator
  # 此处的用你的samtools安装位置在CNVnator目录下建立软链接
  $ ln -s /your/path/of/samtools-1.9/ samtools
  # 安装依赖包yeppp
  $ mkdir yeppp && cd yeppp
  $ wget http://bitbucket.org/MDukhan/yeppp/downloads/yeppp-1.0.0.tar.bz2
  $ tar xjf yeppp-1.0.0.tar.bz2
  $ make clean
  $ make LIBS="-lcrypto"
  # 此处将root软件加入变量中
  $ vim .bashrc
  加入：export LD_LIBRARY_PATH=/your/path/of/root/build/lib:$LD_LIBRARY_PATH
  $ source .bashrc
  # 到这里就安装完了，你也可以建立一个软链接把cnvnator链接到bin目录下，这样就可以直接用cnvnator作为命令
  

• 可以看到安装还是很麻烦的，笔者也是安装了N次才成功，都快崩溃的那种。

• 接下来是使用记录，使用还是很方便的，可以安装github的说明一步一步来，没有什么太难的地方，这里稍微记录一下并介绍个别参数。

• 以我自己的数据为例，我的是生殖细胞系的WGS数据，输入文件是已经比对完的bam文件。

  $ cnvnator -root sample.root -tree /your/path/of/bam
  $ cnvnator -root sample.root -his 100 -d /your/path/of/hg19
  $ cnvnator -root sample.root -stat 100
  $ cnvnator -root sample.root -partition 100
  $ cnvnator -root sample.root -call 100 > sample.cnvnator
  $ awk '{ print $2 } END { print "exit" }' sample.cnvnator | cnvnator -root sample.root -genotype 100 > sample.gt
  $ /your/path/of/CNVnator/cnvnator2VCF.pl -prefix sample -reference hg19 sample.cnvnator /your/path/of/hg19 > sample.vcf
  

• 上面就是常规步骤了，介绍几个点：

  • 首先是 -his 参数的值，也就是bin_size的值，这个可以根据CNVnator作者的建议，根据测序深度的不同进行调整：100X: 30；20-30X: 100；4-6X: 500；再低就1000
  • 其次是 -d 参数，关于这个参数，官网有两种用法：
    1. 如果使用 -d 那就后面接参考基因组所在目录，作者自己是在 hg19 下有各个不同染色体的fasta文件，虽然按照说明是只要目录下有参考基因组就行了。这里笔者一开始目录中只有合并后的hg19的文件，发现下面的步骤报错，后来就重新下载hg19文件，解压后没有合并，运行正常。
    2. 如果使用 -fasta 参数就在后面跟参考基因组的压缩文件，笔者是把 hg19.fa 压缩成了 hg19.fa.gz ，但是后面还是报错了
  • 第六句awk那一句可以不运行，主要是看genotype，不影响最后一步转换为vcf文件

• 到这一步其实也就差不多了，那么下面是关于CNVs数据的一些简单处理方式和意见的记录，这一块笔者也没有仔细去研究，如果有需要可以单独交流。

• 关于CNV结果的注释，这里参考annovar注释：

  $ perl convert2annovar.pl -format vcf4old sample.vcf > sample.avinput
  $ perl table_annovar.pl W001.avinput /your/path/of/annovar/humandb/ --buildver hg19 -remove -out sample -protocol refGene,cytoBand,omim201806,gwasCatalog,CCRS,phastConsElements100way,phastConsElements46way,phastConsElements46wayPlacental,phastConsElements46wayPrimates,tfbsConsSites,rmsk,dgvMerged,HIP,Constraint -operation g,r,r,r,r,r,r,r,r,r,r,r,r,r -nastring . --thread 12
  

• 其实对于 CNVs 的注释和筛选，所能使用的数据库并不像 SNVs 那么多，所幸的是CNVs的结果也没那么多。

• 上面注释所涉及的数据库大多数能在annovar中直接下载，除了omim201806、CCRS、HIP、Constraint。

  • OMIM的数据可以在OMIM官网通过申请下载，这里不方便挂出来，不过笔者最近一次申请都过去几个月了，OMIM还是没有把链接发过来。

  • CCRS的数据可以在笔者之前的文章，关于注释的那一篇中下载并修改格式，但是用在CNVs中参考价值可能不大，可自行查阅。

  • HIP和Constraint的数据来源于DECIPHER，可以作为参考，下面记录一下如何下载并转换格式。

    # DECIPHER数据库提供了在线的可视化的检索方式，可以查看相关变异的很多信息，包括表型、致病性等，这些信息都是临床或科研单位上传的。其中DECIPHER可供下载的数据包括以下三种
    # Haploinsufficiency Predictions:
    #    Updated predictions of haploinsufficiency as described by Huang et al. (2010, PLoS Genetics). Available as a Bed file for download from the link above.
    $ wget https://decipher.sanger.ac.uk/files/downloads/HI_Predictions_Version3.bed.gz
    # Population Copy-Number Variation Frequencies
    #    Common copy-number variants and their frequencies, as used and displayed in DECIPHER.
    $ wget https://decipher.sanger.ac.uk/files/downloads/population_cnv.txt.gz
    # Development Disorder Genotype – Phenotype Database (DDG2P) 
    #    a curated list of genes reported to be associated with developmental disorders, compiled by clinicians as part of the DDD study to facilitate clinical feedback of likely causal variants. Please note: This file is maintained by the European Bioinformatics Institute. Its contents may differ from DECIPHER due to different update cycles.
    $ wget http://www.ebi.ac.uk/gene2phenotype/downloads/DDG2P.csv.gz
    # 上面是下载了三个数据库，当然下面只用到了两个，还有一个频率数据库笔者也不知道怎么去注释和使用比较好
    # 上述三个数据库直接用gunzip去解压就行
    # pLI:
        $ awk -F "\t" '{print 0"\t"$3"\t"$5"\t"$6"\t"$20}' Constraint.txt > hg19_Constraint.txt
        $ sed -i '1d' hg19_Constraint.txt
    # HIP:
        $ sed -i '1d' HI_Predictions_Version3.bed 
        $ bedtools sort -i HI_Predictions_Version3.bed > HIP.txt
        $ awk -F "\t" '{print 0"\t"$1"\t"$2"\t"$3"\t"$4}' HIP.txt > hg19_HIP.txt
    

    • 最后记得把两个数据库放到 humandb 目录下。

    • DECIPHER有对这两个数值进行介绍

      • HIP，参考paper
    HI.png
    • pLI，参考paper
    pLI

• 除此之外，对于CNVs的研究也可以考虑从trio样本出发。考虑思路和snv类似，就是从遗传模式考虑，比如患者父母正常的情况下，可以寻找de novo、AR类型的变异。还有就是可以考虑将CNV的数据结合SNV/INDEL一起分析，主要就是CNV可能与SNV/INDEL构成复合杂合等情况。当然这些都是一些思路。

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