MultiQC软件安装及其运行过程

安装multiqc最简单的方式是用conda进行安装

conda install -c bioconda multiqc

报错

image.png

原因如下：

Conda 是一个开源的软件包管理系统和环境管理系统，用于安装多个版本的软件包及其依赖关系，并在它们之间轻松切换。 Conda 是为 Python 程序创建的。
即conda的使用会受到Python环境的影响，而在前期我们对下载的Python进行了更新使得当前的conda无法使用。

解决如下：

1.将原本的anaconda3删除

rm -rf anaconda3

2.直接运行

sh Anaconda3-5.2.0-Linux-x86_64.sh

3.在下载过程中直到

image.png

输入no
4.此时conda还是无法找到，应当启动它

cd anaconda3/bin
ls

会发现有一个activate

image.png

给activate加权限,激活conda

chmod +x activate

最后启动conda即可

source ./activate

image.png

上述解决办法参照https://www.jianshu.com/p/edaa744ea47d

下面开始安装multiqc

一、conda安装multiqc

conda install -c bioconda multiqc

报错如下：

image.png

解决办法参照https://blog.csdn.net/ada0915/article/details/78529877

1.添加清华的镜像源

conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/msys2/
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free/
conda config --set show_channel_urls yes

2.如果失败

vim ~/.condarc

删除部分内容如下即可：

image.png

3.重启后重新输入

conda install -c bioconda multiqc

查看multiqc是否安装成功及其功能

multiqc -h

image.png

二、获得fastq文件

1.在NCBI中获取SRA文件

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2.为了运行快捷选择两个较小的SRR序列

image.png

image.png

由于前期安装了SRA toolkit，直接

prefetch SRR7511222
prefetch SRR7511256

软件自动建立~/ncbi/public/sra文件夹，并将序列放入其中
3.将SRA文件解压为fastq格式

fastq-dump --gzip --split-files SRR7511222
fastq-dump --gzip --split-files SRR7511256

4.fastqc进行数据质量评价

fastqc SRR7511222_1.fastq.gz
fastqc SRR7511222_2.fastq.gz
fastqc SRR7511256_1.fastq.gz
fastqc SRR7511256_2.fastq.gz

得到如下文件

image.png

三、multiqc进行整合

在当前目录下

multiqc .

生成如下 两个文件
multiqc_data和multiqc_report.html

image.png

将multiqc_report.html download下来并打开该网页

四、结果分析

以下内容参考自https://www.jianshu.com/p/85da4dcc6020

1.所有样本数据基本情况统计

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重复reads的比例（%Dups）、GC含量占总碱基的比例（%GC，比例越小越好）、总测序量（M Seqs，单位：millions）

2.序列的计数

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可以查看reads的数量和其百分比。
根据表可知该四条序列的重复序列都较多。

3.每个read各位置碱基的平均测序质量

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横坐标——碱基的位置
纵坐标——质量分数=-10log10p（p代表错误率），所以当质量分数为40的时候，p就是0.0001。此时说明测序质量非常好。
绿色区间——质量很好，橙色区间——质量合理，红色区间——质量不好。
由此可知，四个样本在200个碱基前的测序质量平均线都在绿色区域内，质量很好，而200个碱基后测序质量大部分合理，SRR7511256_2的不合格。

4.具有平均质量分数的reads的数量

image.png

绿色区间——质量很好
橙色区间——质量合理
红色区间——质量不好
由上图可知4个样本基本都在绿色区域，测序质量合格。

5.每个read各位置碱基ATCG的比列

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reads每个位置的颜色显示由4种颜色的比例混合而成，哪一个碱基的比例大，则趋近于这个碱基所代表的颜色。
正常情况下每个位置每种碱基出现的概率是相近的。
由上图可知4个样本在14个bp前的ATCG的含量比例是非常不均匀的，可能有过表达序列的污染，测序质量不好。

6.reads的平均GC含量

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正常的样本的GC含量曲线会趋近于正态分布曲线。
由上图可知GC含量曲线不符合正态分布曲线，曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差，测序质量不好。

7.每条reads各位置N碱基含量比例

image.png

当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，统计N的比率。正常情况下，N值非常小。
由上图可知样本的N碱基的含量为0，每个位置的碱基都能确定，测序质量很好。

8.序列长度的分布

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所有样本的序列都是单一长度（250bp）。

9.每个序列的相对重复水平

image.png

横坐标：每个序列的相对重复水平
纵坐标：在文库中的比例
由上图可知每个样本序列的相对重复水平都较高，测序质量不好。

10.文库中过表达序列的比例

image.png

横坐标——过表达序列的比例
一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。

由上图可知4个样本的过表达序列比例都远远超过了1%，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。测序质量不好。

11.接头含量

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4个样本的接头含量都小于0.1%

总的来说，该4个样本的重复序列太多，ATCG分布不均匀，有过表达序列污染的可能。