二代测序平台的介绍

一、测序技术的发展史

高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的Sanger测序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer）（已终止服务），Illumina公司的测序仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。

二、各个平台的测序原理

1、454测序仪

将焦磷酸测序应用在测序技术上。构建的文库（3' 和5'端分别加上接头），所含接头会使DNA片段结合到微珠上。测序PCR反应就发生在固相的微珠上，并且整个PCR反应和相关的酶被油包水的液滴包裹，每个油滴系统只包含1个DNA模板。扩增后，每个DNA分子可以得到富集，每个微珠只能形成一个克隆集落。454测序仪的测序通道体积非常狭小，只能容纳一个微珠。测序过程中，GS FLX系统会将引物上dNTP的聚合与荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号，就可以达到DNA测序的目的。

2、illumina测序仪

illumina的测序原理是可逆终止化学反应。DNA片段加上接头之后，可以随机的附着于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面经过桥式扩增。这样就形成了数千份相同的单分子簇，被用做测序模板。测序采取边合成边测序的方法，和模板配对的ddNTP原料被添加上去，不配对的ddNTP原料被洗去，成像系统能够捕捉荧光标记的核苷酸。随着DNA 3'端的阻断剂的去除，下一轮的延伸就可以进行。

3、SOLiD测序仪

ABI Solid技术的核心是4种荧光标记寡核苷酸的连接反应测序。测序之前，DNA模板通过乳化PCR扩增，和Roche 454的基本相同，只是Solid的微珠更小，只有1μm。3'端修饰的微珠可以沉淀在玻片上。连接测序所用的底物是8个碱基荧光探针混合物，根据序列的位置，样品DNA就可以被探针标记。DNA连接酶优先连接和模板配对的探针，并引发该位点的荧光信号的产生。

4、Ion torrent测序仪

Ion Torrent平台采用半导体芯片测序原理，使用了一种高密度半导体小孔芯片，该芯片置于一个离子敏感层和离子感受器之上，每当有核苷酸分子被掺入时就会释放出质子，而离子感受器就会感受到这种信号，知道是哪一个核苷酸被掺入，从而读出DNA序列。

目前主流的测序仪是illumina公司的测序仪，下面主要介绍illumina的测序流程：

三、Illumina测序流程

1 文库构建

1.1 靶基因的文库制备：

 

靶基因建库一般采用PCR扩增的方法，同时将测序所需要的接头index序列和添加到靶基因的两端，将不同的样本按照等摩尔比混合后完成文库的构建。

 

1.2 宏基因组DNA文库的构建：

1. 随机打断。有两种方法：酶切法和随机打断法。常用的是随机打断法。
2. 末端修饰。打断的片段是随机断裂，其末端可能是不平的。因此，建库第一步是补齐不平的末端。
3. 添加接头。经过末端修饰后的DNA片段3’末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用连接酶将接头添加到DNA片段两端，形成“Y”形接头。加接头是为了区分样本。
4. PCR扩增。添加了接头的DNA片段，可通过与接头互补的引物来扩增，富集文库。
5. 文库制备的目的是在需要测序的DNA片段两端加上能够与测序仪配合的接头序列。文库制备是决定测序实验成功与否的关键

 

2、簇（cluster）生成

单链化的文库DNA片段进入Illumina测序平台的流通池（flow cell）后，可以与流通池表面的寡核苷酸结合，从而进入测序过程。

 

1. 首先以寡核苷酸（2个）为引物、文库片段为模板进行DNA复制。复制完成后解链，将文库片段洗去，留在流通池表面的是与文库模板互补的DNA链。
2. “桥”式扩增。单链DNA另一端为不同的接头序列，可以与相邻的另一种寡核苷酸互补结合，进行“桥”式扩增。扩增完成后，原来散布在表面的单核苷酸序列变成散布的DNA簇，基因簇在测序时比单分子产生的光信号强很多，更易于检测到。

3.

 

边合成边测序。流通池中加入测序引物Read1 SP、DNA聚合酶，连有不同颜色的可逆终止荧光基团的dNTP，一个循环只能延长一个碱基，然后清除游离的dNTP，使用激光扫描，判断是哪种碱基。一个循环结束之后就加入一些化学试剂把叠氮基团和标记的荧光基团切掉，使3’端的羟基暴露出来，再加入新的dNTP和聚合酶进入下一个碱基的测序反应。

4.

Read1结束后，解链并洗掉测序中已经合成的部分，加入测序引物Index引物（也即Read2 SP互补的寡核苷酸），这时会继续在3’端进行复制，读出接头中Index序列，从而可以确定出每个位点的DNA属于哪个文库。

 

四、454测序流程

1. 文库制备：靶基因或宏基因组的文库构建，经末端修复与特异性接头连接修饰后变形处理回收单链DNA
2. Emulsion PCR：单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，回收纯化
3. 测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入Pico Titer Plate（PTP）板中供测序反应使用，它含有160多万个有光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，按照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和序列模板进行配对，就会捕获到一份子的光信号，由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列

五、SOLid测序流程

1. 基因组文库的构建：片段打断并在片段两端加上测序接头，或靶基因扩增添加接头，连接载体，构建单链DNA文库。
2. Emulsion PCR：Solid的PCR过程也和454的方法类似，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。

 

3）测序：

SOLiD“双碱基编码原理”实质上是阐明了荧光探针的颜色类型与探针编码区碱基对的对应关系。SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。底物探针5’末端可分别标记“CY5，Texas Red，CY3，6-FAMTM”4种颜色的荧光染料，并且这四种颜色用数字“3，2，1，0”示意；探针3’端1~5位为随机碱基，可以是“A，T，C，G”四种碱基中的任何一种碱基，其中第1、2位构成的碱基对是表征探针染料类型的编码区，“双碱基编码矩阵”规定了该编码区16种碱基对和4种探针颜色的对应关系，而3~5位的“n”表示随机碱基，6~8位的“z”指的是可以和任何碱基配对的特殊碱基，由上可知，SOLiD连接反应底物中共有45种底物探针。

单向SOLiD测序包括五轮测序反应。每轮测序反应含有多次连接反应（一般情况下，片段文库是7次，mate-paired文库是5次，所以片段文库共有35个连接反应，而末端配对文库共有25次连接反应）。每轮测序反应的第一次连接反应由与P1引物区域互补的“连接引物”介导。这五种连接引物长度相同，但在P1引物区域的位置相差一个碱基（分别用n，n-1，n-2，n-3，n-4表示），都含有5’端磷酸，所以可以介导连接反应的进行。第一轮测序的第一次连接反应由连接引物“n”介导，由于每个磁珠只含有均质单链DNA模板（也就是每个磁珠表面的单链DNA模板序列都是一样的），所以这次连接反应掺入一种8碱基荧光探针，SOLiD测序仪记录反应模板序列第1、2位碱基序列的探针第1、2位编码区颜色信息，随后的化学处理断裂探针3’端第5、6位碱基间的化学键，并除去6~8位碱基及5’末端荧光基团，暴露探针第5位碱基5’磷酸，为下一次连接反应作准备。由此我们知道第一次连接反应使合成链多了5个碱基，所以第二次连接反应得到反应模板序列第6、7位碱基序列的颜色信息，而第三次连接反应得到的是第11、12位碱基序列的颜色信息… … 以此类推，第一轮测序反应获取了模板链7个碱基对的颜色信息。如图5所示，由于第二轮连接引物n-1比第一轮错开一位，所以第二轮得到是以0，1位起始的7个碱基对的颜色信息。五轮测序反应反应后，按照第0、1位，第1、2位... …的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3”组成的SOLiD原始颜色序列。

 

六、Ion torrent测序流程

1. 文库构建：建库是在样本DNA片段的两端加上标准的接头。
2. 乳液PCR：Ion Torrent把文库种到测序珠子上去的方法，是做油包水PCR，也叫emulsion PCR（乳浊液PCR）。油包水PCR包括两个相：油相和水相。其中水相是核心，油相起到分隔作用。
3. 测序：Ion Torrent 测序仪是第一个不需要光学系统的商业测序仪，采用半导体测序，通过半导体芯片直接将化学信号转换为数字信号。

 

七、技术平台对比

技术平台	特点
Roche/454测序技术	1.454平台的突出优势是读长，每轮测序能产生100万个读长片段，读长可达400-500bp； 2.主要的错误来自于同聚物，即相同碱基的连续延伸； 3.读出的片段较短，而且不能提供配对端点测序信息
Illumina/Solexa测序技术	1.每张测序芯片有8个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测； 2.一次实验可读取大于15亿个碱基/芯片； 3.可精确读取重复序列如AAAAAAAA，TTTTTTTT； 4.实验费用低，测序成本为传统测序方法的1/100； 5.应用范围极广，几乎囊括了目前基因组研究的所有方法； 6.扩增时容易引入孔增错误累计，导致测序精确度降低
ABI/SOLid测序技术	1.SOLid测序平台准确度能够达到99.94%，在片段覆盖率为15×时，测序精确度可接近100%； 2.该技术的读长在2×50bp，可读取序列较短，后续序列拼接同样比较复杂； 3.荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误
Ion Torrent测序技术	1．无以伦比的快速，2个小时完成测序工作；Ion Torrent的化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度。 2．测序通量目前还不够大，增加半导体芯片的容量将有望提高测序仪的处理能力。