An integrative functional genomics approach reveals EGLN1 as a novel therapeutic target in KRAS mutated lung adenocarcinoma--15.302--molecular discovery

思路

对KRAS突变的A549细胞进行CRISPR/cas9筛选→与公共数据库depmap进行比较→ CERES方法进行数据筛选（与Depmap数据库的方式一致）→选取KRAS突变型和野生型中CERES评分不同的1374个基因→筛选评分找到88个与KRAS突变密切相关的基因→基因-药物相互作用数据库找到四个潜在的药物靶点→ EGLN1在肺腺癌中的依赖性未报道过→探究EGLN1的功能和机制

一、Main text

在这项工作中，我们进行了一项综合的功能基因组分析，结合了大量癌症细胞系的体外依赖性数据、基因药物能力信息以及患者的转录组学和突变数据。通过这种方法，我们确认并验证了EGLN1基因是一种新的药物依赖性，优先与KRAS突变的肺腺癌相关

二、result

1、与kras突变相关的肺AD依赖性的鉴定

①为了确定可作为新治疗靶点的依赖性基因，我们在来源于KRAS突变肺AD的A549细胞系中进行CRISPR/cas9筛选[5]
②为了验证我们的筛选结果，我们对不同和补充组学来源进行了基于数据整合的分析（图1a）。首先，我们将我们的筛选数据与通过DepMap门户网站获得的73个肺癌细胞系的必要性数据进行了比较[6]。
③DepMap数据通过CERES算法标准化，允许比较不同细胞系的必要性筛选数据，并为每个基因分配一个分数，最负的分数分配给最敏感的基因[6]。我们将CERES方法应用于筛选数据，如CERES分数的累积分布所示（图1b），我们的标准化结果与DepMap数据一致。因此，我们将A549数据集与肺癌DepMap数据整合，并使用RNA测序数据筛选表达基因
④为了确定优先与KRAS突变遗传背景相关的依赖性基因，我们挖掘了KRAS突变和KRAS野生型肺癌细胞系的依赖性图谱，提取了1374个具有显著不同CERES评分的基因（图1c）。
⑤为了进一步完善这个基因列表，我们选择了KRAS突变细胞系与KRASwild型细胞系中得分较低的基因，并将CERES得分的依赖性（D）阈值设为−0.3，表示A549细胞中常见必需基因的平均值加上两个标准差。在这一步中，我们鉴定了88个基因，代表了与KRAS突变密切相关的依赖性基因背景。丰富分析表明，这种信号与细胞凋亡调节和范可宁血症相关途径显著相关（图1d）。值得注意的是，凋亡解除和DNA修复缺陷都是KRAS驱动的肺癌中众所周知的改变，支持我们分析的有效性[7，8]。

2、EGLN1作为一种新的药物依赖性

①为了选择可能成为化学物质靶点的基因，我们通过查询基因-药物相互作用数据库来挖掘我们的特征码[9]。除了KRAS，我们还确定了四个潜在的候选基因（图1e），包括蛋白酶体亚单位PSMF1和细胞周期蛋白激酶CDK4，从而证实了已经报道的KRAS突变肺癌对蛋白酶体和CDK4抑制剂的敏感性增强[10,11]。这些结果进一步支持了我们方法的有效性。
②在这些潜在的候选药物中，我们将注意力集中在EGLN1上，因为它的依赖性在KRAS突变的肺AD中从未被报道过。EGLN1基因编码PHD2脯氨酰羟化酶，缺氧传感器，调节HIF转录因子活性。在有氧条件下，EGLN1使hifα亚基羟基化，导致VHLadaptor识别，从而促进泛素化复合物的结合和随后的蛋白酶体介导的降解。相反，在缺氧条件下，EGLN1不起作用，HIFα亚单位稳定，激活了导致细胞缺氧适应的转录程序[12]。与多个EGLN1介导过程的存在相一致，根据上下文，EGLN1被定义为抑癌基因或癌基因[13，14]。
③我们通过比较不同来源的癌细胞系中的小脑孔，验证了EGLN1是否代表了与其他癌症类型的共同依赖性（图1f）。值得注意的是，对EGLN1最上瘾的细胞系是KRAS突变的AD和卵巢癌细胞，证实了透明细胞卵巢癌中已知的对该基因的依赖性[13]。有趣的是，在另一种KRAS突变的肿瘤性疾病大肠癌中，在KRAS突变和KRAS-WT细胞系中，EGLN1的得分都非常接近于零，这表明肺癌对该基因有特殊的依赖性（图1f）
④为了深入了解EGLN1在肺癌发生中的这一新作用，我们评估了其在TCGA腺癌队列[15]和从我们研究所的实验室检索到的一组患者样本中的表达水平生物银行。很明显肿瘤组织中EGLN1在mRNA和蛋白水平的表达明显高于周围组织健康肺组织（图1g-i）
⑤我们在巨噬细胞检测到EGLN1的强烈表达，表明该蛋白在肿瘤炎症微环境中可能起作用（图1i）。值得注意的是，在TCGA AD队列中，EGLN1高表达也与预后不良有关，而且在KRAS突变患者中，总生存率的差异更为明显（图1j）
⑥为了验证EGLN1的作用，我们在含有两个sgRNAs的KRAS突变AD细胞系中获得了敲除（KO）（图2a）。如图2b所示，EGLN1KO在竞争试验中导致显著的增殖损伤，在不同KRAS突变的AD细胞系中获得相似的结果（数据未显示）。

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3、EGLN1的促癌活性部分依赖于HIF1A

①为了进一步了解EGLN1控制的癌前机制，我们依赖于一种观点，即共同依赖可以用来识别具有相似功能的基因[16]。我们发现EGLN1 CERES评分与VHL基因和负性利康乐酯的得分与HIF1A基因评分（图2f-g）有显著相关性，提示癌细胞易失活EGLN1可能与HIF1α上的典型功能有关规章制度。的确，EGLN1KO或莫利杜司他治疗诱导HIF1α稳定（图2h-i）。为了进一步研究这个假设，我们将共敲降了EGLN1和HIF1A基因（图2h
②如图2j所示，HIF1A-KO减弱了EGLN1依赖性，而没有完全挽救在单个EGLN1-KO中观察到的受损细胞增殖。其他KRAS突变的AD细胞系也获得了类似的结果（数据未显示）。这些数据表明，尽管HIF1α蛋白被egln1ko稳定，但它的稳定只是egln1ko对细胞增殖不利影响的部分原因。
③我们假设至少有两种机制是KRAS突变AD中EGLN1依赖性的基础：一种是HIF1α依赖性，而另一种是isHIF1α非依赖性（图2k）。这与Price及其合作者报道的数据形成了部分对比[13]，表明卵巢癌对EGLN1抑制剂的敏感性需要完整的HIF1α。需要进一步的研究来阐明解释KRAS突变肺AD中EGLN1依赖性的其他机制

三、conclusion

总的来说，我们的结果揭示了在KRAS突变的肺AD中EGLN1基因先前未知的致癌功能。EGLN1抑制剂目前正在进行贫血的临床试验，证明了良好的耐受性和安全性[17]。我们的发现支持将这些药物重新用于肺癌治疗，如单药治疗或与其他化合物联合治疗

四、材料与方法

DepMap数据集可用网址：http://depmap.org/portal/
基因药物相互作用数据集网址：http://www.dgidb.org/
RNA测序和TCGA肺癌患者队列的临床数据可用网址：http://www.cancer.gov/tcga。
本研究中使用和/或分析的所有其他数据集，以及材料和方法信息，可根据合理要求从通讯作者处获得。