Cell | 癌前程序和微环境绘制大肠息肉恶化路径图（二）
原创 huacishu 图灵基因 2022-01-07 07:03
收录于话题#前沿分子生物学机制
撰文：huacishu
IF=41.583
推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐
亮点：
1、作者绘制了人类腺瘤和锯齿状息肉的单细胞分辨率图谱；
2、作者证明锯齿状息肉源于化生，而不是干细胞扩张；
3、作者证明锯齿状息肉的细胞毒性免疫独立于超突变；
4、作者证明不同的免疫微环境可以跟踪肿瘤细胞分化状态。
范德堡大学Ken S. Lau博士课题组在国际知名期刊Cell在线发表题为“Differential pre-malignant programs and microenvironment chart distinct paths to malignancy in human colorectal polyps”的论文。结直肠癌（CRC）起源于结直肠息肉，其细胞起源、分子异质性和免疫原性可能在高分辨率分析时揭示诊断和治疗见解。文章展示了两种最常见的人类结直肠息肉的单细胞转录组学和成像图谱，即常规腺瘤和锯齿状息肉。对62名参与者的128个数据集进行综合分析后发现，腺瘤起源于WNT驱动的干细胞扩增，而锯齿状息肉则来源于通过胃化生分化的细胞。化生相关损伤与超突变前的细胞毒性免疫微环境相耦合，部分原因是与肿瘤细胞分化状态相关的抗原呈递差异。作者的的多组学图谱提供了大肠息肉恶性进展及其微环境的见解，作为精确监测和预防结直肠癌的方法。
采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、多重免疫荧光（MxIF）和多重免疫组织化学（MxIHC）进行研究。发现（DIS）集包括65个分析标本，包括30个肿瘤。验证（VAL）集包括63个分析样本，包括32个肿瘤（图1A）。总的来说，在62个肿瘤上生成了128个独立的scRNA序列数据集。标本来自不同性别、种族和年龄组。此外，分别对66个和281个息肉进行了大量RNA序列和靶向基因测序。在组织学上将息肉分为两个亚型：由管状ADs（TAs）和管状类ADs（TVAs）组成的ADs，或由增生性息肉（HPs）和SSL组成的锯齿状息肉（SER）（图1B）。通过进行全外显子组测序（WES）和体细胞突变调用（图1C），对ADs和SER的突变谱进行了表征。由于息肉体积小，单细胞分析优先考虑新鲜组织，使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）材料进行WES。在85%的TA和两种TVA中检测到APC突变。只有一个（8%）TA有KRAS突变，而两个TVAs都有。除了一个SSL（89%）外，所有SSL都有致癌BRAFV600E突变；三个GCHPs中没有一个携带BRAF突变，但有两个（67%）MVHPs携带BRAF突变，这与MVHPs是进化中的SSL一致。在SSLs中未检测到APC和KRAS突变，并且所有ADs均未检测到BRAF突变。令人惊讶的是，没有一个SSL表现出超突变表型，而一部分TA/TVA表现出超突变表型。由于启动子甲基化，MSI-H CRC中的MLH1表达通常丢失，而SSLs中的MLH1蛋白和基因表达与ADs相当，两者均高于MSI-H CRC的平均水平。在任何息肉中均未检测到错配修复基因的双等位基因缺失，进一步证明这些SSL尚未获得超突变表型。
由于转录因子（TF）定义的调控子活动被认为是细胞身份的决定因素，因此使用SIVENT（单细胞调控网络推断和聚类），这是一种基于调控子的提取工具，用于调整息肉特异性效应。将DIS数据集中的上皮细胞聚集，以正常活检数据集为参考标志，显示了七个正常、规范的上皮细胞群（图2A和2B）。息肉标本也含有大量与其组织病理学一致的正常细胞（图1B、2B）。然而，两个细胞群体在息肉样本中占绝大多数，这是由比例聚类代表性的逐样本细分确定的（图2B和2C）。一个群体富含TA和TVA，以下称为ASCs（AD特异性细胞）。第二个肿瘤群体富含SSL和HPs，以下称为SSC（锯齿状特异性细胞）。重要的是，这些结果以及下面的其他结果在DIS和VAL数据集中是一致的（图2A-2C），证明了其精确性和再现性。ASC类似于结肠干细胞和祖细胞，表达WNT通路激活的基因（LGR5、OLFM4、ASCL2、AXIN2、RNF43和EPHB2）（图2A），并且具有比来自相同个体的正常干细胞更大的干细胞特征（图2D）。由于ASC与正常干细胞相似，使用细胞追踪来推断其干细胞潜能。正常干细胞具有较高的细胞追踪分数，并转化为分数较低的分化细胞（图2E），形成了干细胞、转化细胞和分化细胞之间相对一致的分数分布。相比之下，ASCs的细胞追踪分析得出的分布偏向具有高预测干细胞潜能的细胞（图2E）。利用TF靶点相似性创建了一个共同的TF调节网络，描述了基因作为程序和途径的协调调节。一些协调的调控子簇，称之为超级调控子，在ASC和SSC中的比例过高，包括以MYC、ASCL2、TCF7和TEAD1活性为标志的WNT-和Hippo-驱动的超级调控子（图2F），与这些程序在肠干细胞再生和更新中的作用一致。对于支持损伤诱导化生过程作用的SSC，观察到一个超级调节子，指示白细胞介素信号和微生物群相互作用（图2G）。在另外58个ADs（36个TA，22个TVA）和8个SSL上，用批量RNA序列验证了分类息肉亚型的基因特征。这些结果证实了作者的发现：在ADs中，WNT激活了干细胞扩增程序，在SSLs中，WNT激活了胃化生程序。
由于SSC可能来源于分化细胞的化生，作者假设SER来源于肿瘤发生的“自上而下”模型中的分化细胞，而ADs来源于“自下而上”方式的增殖性干细胞。为了提供肿瘤起源的组织学证据，通过多重成像绘制了肿瘤细胞的位置。干细胞标记OLFM4和SOX9在ADs中大量存在，但在HPs和SSL中显著减少（图3A和3B）。在正常结肠和ADs中检测到核CDX2，但在HPs中减少，在SSLs中缺失（图3C）。SSC标记物MUC5AC在HPs和SSL中高表达，但在正常活检和ADs中不表达（图3D）。细胞追踪评分和WNT靶基因重叠确定了干细胞分支，与ASC共享，表明异常扩增的干细胞是ADs的起源（图3E）。与此形成鲜明对比的是，推测SSC是由吸收祖细胞和结肠细胞发育而来。对单个肿瘤的RNA速度分析基本上证实了这些发现（图3F）。在正常标本中，速度载体起源于干细胞，并流入分化的细胞类型。ASC被认为是由干细胞发育而来的，但SSC的速度向量是相反的，这表明这些细胞的起源是非干细胞。
恶性CRC细胞的scRNA-seq数据显示了实质性的肿瘤间变异性（图4A）。结合癌前数据，随着上皮细胞从正常细胞向癌前细胞转化为恶性细胞，观察到肿瘤间异质性增加。通过使用来自ADs和SERs的预先鉴定的基因集，观察到MSS和MSI-H CRC细胞都保留其各自前体的部分。比较两种亚型，MSS CRC细胞过度表达再生干细胞的特征，MSI-H CRC细胞保留化生特征（图4B和4C）。为了进一步支持癌症前期和癌症之间的共性，按照分子亚型（CMS）对ASC、SSC和CRC细胞进行分类（图4D）。ASCs和MSS CRC细胞对CMS2评分较高，CMS2是最常与WNT通路失调相关的亚型。相反，SSC和MSI-H CRC细胞在CMS2中得分较低，但在CMS1和CMS3中得分较高，这两种细胞分别具有免疫原性和RAS通路激活。作者还研究了从癌前病变向恶性肿瘤转变过程中获得或丢失的特征。与SSC相比，MSI-H CRC细胞显示出相对减少的化生特征。然而，与干细胞内的关键基因相比，WNT-SSC被激活。细胞追踪分析表明MSI-H CRC细胞比SSC具有更高的干细胞潜能，而MSS CRC细胞的得分也高于ASC（图4E）。基因调控网络分析更清楚地证明了在恶性转化过程中分子途径是如何维持或改变的，这一点得到了GSEA的支持（图4F-4I）。与息肉相比，两种CRC亚型都激活了它们的增殖超级调节子，并丰富了DNA合成和修复程序（图4F-4I）。WNT信号超级调节子在ASC和MSS CRC细胞中持续上调（图4F和4G）。对于MSI-H CRC细胞，描述SSC中病原体损伤反应的超级调节子被抑制，但先前在SERs中被抑制的WNT信号超级调节子被激活（图4H和4I）。这些结果表明MSI-H CRC通过转化为更具攻击性的干细胞样细胞而获得非化生的功能。
作者进一步查询了来自TCGA的63个批量RNA序列数据集，并验证了CMS亚型与化生性特征之间的关联。然而，在单个肿瘤的基础上，这些数据比scRNA-seq数据更具噪声性，可能是由于数据质量差和额外的肿瘤内异质性造成的。引人注目的是，没有一个MSS CRC（0/17）对MUC5AC呈阳性，但大多数MSIH CRC（13/14）呈阳性（图5A和5B）。然而，在阳性的MSI-H CRC中，MUC5AC染色的肿瘤面积是可变的。CDX2染色呈相反趋势；实际上，MSS CRC中的所有肿瘤细胞均为CDX2阳性，MSI-H CRC的CDX2染色有不同程度的减少。干细胞标记物（OLFM4，SOX9）在整个MSS CRC中表达，并且它们一致缺乏MUC5AC表达（图5C和5D）。相反，MSI-H CRC显示出相当大的肿瘤内MUC5AC异质性，在MSI-H CRC的某些区域染色较低；这些区域对OLFM4和某种程度的CDX2呈阳性（图5E-5H）。对单个scRNA序列数据集的集中分析验证了这些结果。MUC5AC和MSLN阳性表达，再加上CDX2表达缺失，使同一肿瘤内的化生细胞与LGR5/b-连环蛋白表达的增殖性干细胞区分开来（图5I、4C和4E）。
由于SERs未显示超突变，而MSIH CRC显示超突变，作者试图确定SERs在早期是否具有独特的肿瘤微环境。结合对来自癌前病变和CRC的非上皮性scRNA-seq数据的分析，并根据标记基因表达及其在肿瘤亚型之间的组成变化确定不同的细胞类型（图6A和6B）。与正常组织相比，大多数免疫细胞类型在息肉中增加，包括CD4+T细胞，尽管许多在息肉亚型之间没有差异（图6C）。AD衍生的与正常结肠CD4+T细胞相比，FOXP3调节子活性更高，这与一定程度的Treg依赖性免疫抑制一致（图6D）。ASC表达吸引单核细胞的趋化因子信号，而SSC表达吸引淋巴细胞的细胞因子信号，这对建立适应性免疫环境很重要（图6E）。与ASC相比，SSC中的抗原处理和呈递基因特征显著更高，MSI-H CRC细胞中的抗原处理和呈递基因特征也比MSS CRC细胞高（图6E）。这些数据表明，从癌前到癌症，一些适应性免疫调节机制的持续存在似乎与超突变无关。多重成像显示，与ADs相比，SERs具有更高数量的T细胞、CD8+T细胞和更高比例的CD8+与CD4+T细胞（图6F和6G），而其他免疫细胞群没有显著差异。骨髓样细胞的丰度在scRNA-seq和成像上没有差异，但CD68+巨噬细胞分布在整个AD基质中，而它们集中在SERs的管腔表面，与MUC5AC+化生细胞的表面位置一致（图6H）。在MUC5AC+化生区CD8+T细胞显著富集，在OLFM4+区CD8+T细胞数量减少（图6I）。相比之下，MSS CRC在整个肿瘤中的T细胞较少，它们均匀地由OLFM4+干细胞样细胞组成（图6I）。这些结果加强了SERs的化生起源与细胞毒性免疫微环境之间的联系。
为了确定锯齿状肿瘤发生中的细胞毒性反应是否是超突变前肿瘤细胞状态的固有因素，使用了模拟早期肿瘤发生事件的基因工程小鼠。Lrig1CreERT2/+；Apc2lox14/+是AD通路的模型，导致远端结肠腺瘤性肿瘤。驱动Braf激活突变不会导致肉眼可见的肿瘤，但会导致近端结肠绒毛状化生（图7A）。与对照正常结肠相比，Apc突变肿瘤的b-连环蛋白染色升高，CD8+T细胞数量减少，这与人类ADs和MSS CRC一致。相比之下，Braf突变病变与CD8+T细胞浸润增加相关，明显的是，仅在分化细胞室中，而在突变隐窝中没有（图7B和7C）。使用免疫染色和转录组学，确定Mist1+细胞代表结肠隐窝基底外的一个细胞子集。重要的是，Mist1+细胞通过Apc的双等位基因重组（Mist1CreERT2/+；Apc2lox14/2lox14）引发结肠肿瘤（简称Mist1肿瘤），随后发生2.5%的DSS损伤，代表了一种非干细胞驱动的肿瘤模型。每只小鼠近端结肠与远端结肠的Mist1肿瘤发生率为7:1（图7D和7E），这与Lrig1CreERT2/+中肿瘤的远端结肠优势不同。为了解释这两种肿瘤类型的分子结构，对肿瘤组织和对照结肠进行了scRNA-seq，并鉴定了肿瘤特异性细胞，包括异常的Paneth细胞（图7F-7H）。由于一种常见的WNT驱动的突变过程，来自两种肿瘤类型的肿瘤特异性细胞（TSC）形成了一个Lgr5过度表达的细胞群，而没有化生基因特征（图7G-7I）。此外，两种肿瘤类型的b-连环蛋白染色均升高，反映WNT被激活（图7E）。虽然肿瘤类型之间的突变过程相同，但作者发现免疫微环境存在显著差异。Mist1肿瘤与SERs类似，含有较高比例的CD8+T细胞（图7J-7M）。这些细胞表达活性细胞毒性和杀伤效应物的标记物（图7N）。Lrig1肿瘤具有明显的功能失调的CD4+T细胞群（图7J-7M）。这些细胞表达免疫抑制标记物，如Pdcd1（PD1）、Ctla4、Prdm1和Havcr2（TIM3），以及Foxp3调节子基因，表明功能失调的T细胞具有调节特性（图7N）。多重成像显示，与Lrig1肿瘤相比，Mist1肿瘤中浸润CD8+T细胞的肿瘤数量显著增加，但CD4+T细胞的数量不明显（图7O和7P）。为了将上皮干细胞与微环境差异联系起来，应用细胞追踪显示Lrig1 TSC具有显著更高的推断干细胞潜能，并且比Mist1 TSC表达更多的干细胞和分化程度更低的细胞基因（图7Q）。反过来，Lrig1肿瘤细胞在形成类器官方面明显比MIST 1肿瘤细胞更成功（图7R）。从先前定义与免疫细胞相互作用相关的正常肠道干细胞的干细胞梯度（ISCI>ISCI>ISCII）的工作中，发现Lrig1 TSC表现出较高的ISCI分数，而Mist1 TSC表现出较高的ISCI和ISCII分数（图7S）。与ISCII和ISCII增加的抗原呈递能力一致，Mist1 TSC也增加了抗原呈递机制的表达（图7T和7U）。Mist1类肿瘤细胞比Lrig1类肿瘤细胞处理和表达更多的抗原，这通过DQ-OVA的内吞作用和蛋白水解以及I-A/I-E染色反映，表明表面抗原表达（图7V）。为了支持这一观察，与Lrig1类肿瘤相比，Mist1类肿瘤在呈现OVA肽时刺激T细胞增殖的能力增强（图7W）；与正常远端结肠相比，在Lrig1类肿瘤中观察到这种作用受到抑制。与ADs相比，人类类肿瘤分析显示人类SERs中的干细胞容量降低，同时抗原呈递基因特征增加（图6E）。
本研究作者提出了一个多组学人类癌前图谱，该图谱整合了单细胞转录组学、基因组学和免疫组织病理学，描述了两种最常见的结直肠癌途径。确定并在功能上验证了建立不同肿瘤景观的不同起源和分子过程。值得注意的是，只有通过对CRC原始病变的观察，才能更清楚地了解晚期和高度异质性癌症，从而为精确预防、监测和治疗的新策略铺平道路。
教授介绍
Ken S. Lau博士就职于范德堡大学，实验室的中心目标是了解炎症微环境，是如何向上皮细胞发出信号以改变其表型的。微环境信号被精确调节，以限制和维持上皮细胞、管腔微生物和潜在免疫细胞之间的稳态。平衡失调会导致炎症性肠病和结直肠癌等疾病。Ken S. Lau博士利用单细胞方法，如解剖细胞因子（Simmons et al.，2015）、多重成像（MxIF）（McKinley et al.，2017）和单细胞RNA序列来查询单细胞状态。Ken S. Lau博士的目标是在体内揭示上皮细胞群体（如癌症干细胞）的异质性和可塑性程度，并将这些知识转化为治疗上可处理的靶点。
参考文献
Chen B, Scurrah CR, McKinley ET, et al. Differential pre-malignant programsand microenvironment chart distinct paths to malignancy in human colorectalpolyps. Cell. 2021;S0092-8674(21)01381-7. doi:10.1016/j.cell.2021.11.031