文献下载链接：Dual checkpoint blockade of CD47 and PD-L1 using an affinity-tuned bispecific antibody maximizes antitumor immunity
发表期刊：Journal for ImmunoTherapy of Cancer
影响因子：12.469
发表时间：2021年9月
单细胞转录组测序用于 临床前期-药效评估与安全性机制研究
药物进入临床I期实验，招募非小细胞肺癌、头颈部鳞癌、卵巢癌患者：（辉瑞）PF-07257876 - ClinicalTrials.gov
1. 文章摘要
作者开发了一种新的亲和调节双特异性抗体，靶向CD47和程序性死亡配体PD-L1（对PD-L1具有强亲和力，对CD47具有中等亲和力），以拮抗固有和适应性免疫检查点通路。通过对小鼠、食蟹猴的抗体治疗试验的scRNA-seq分析，认为与单特异性αCD47和αPD-L1抗体联合治疗相比，αCD47/PD-L1独特的结合选择性导致了独特的巨噬细胞和树突状细胞（DC）的激活，以及肿瘤微环境中干细胞样祖细胞和效应CD8+ T细胞的增加。
1. 文献背景（CD47 和 PD-L1）
1.1 PD-1/PDL1途径
虽然阻断PD-1或PD-L1的治疗干预可以释放抗肿瘤T细胞免疫，但在许多肿瘤患者中，免疫反应仍然受到抑制。因此对于此类患者，或许存在多个肿瘤免疫逃逸途径，不能仅通过抑制PD-1/PDL1来解决。
1.2 CD47/SIRPα途径
CD47是免疫球蛋白超家族中的一种细胞表面分子，是在各种恶性细胞上过表达的另一个已确定的靶点，已被通俗地描述为“不吃我”信号的调节因子。作为固有免疫抑制检查点，当CD47与存在于各种髓系细胞上的受体SIRPα结合时，它会阻断髓系细胞对肿瘤细胞的吞噬作用及下游的固有免疫反应的激活。在临床前模型中，CD47过表达也被证明是对PD-1/PD-L1治疗的耐药性机制。
1.3 αCD47与αPD-1/ PD-L1联合用药的局限性
单特异性αCD47抗体治疗在血液系统恶性肿瘤中尤其成功，如非霍奇金淋巴瘤（NHL）。不幸的是，迄今为止，即使αCD47与αPD-1/ PD-L1药物联合使用，在实体肿瘤患者中观察到的疗效也有限。对实体肿瘤缺乏疗效的一种解释是不能有效地靶向肿瘤，因为CD47广泛表达于循环红系、髓系和其他造血来源的细胞上。其高治疗剂量显示出对红细胞的吞噬作用而导致贫血。
1.4 抗体设计亮点
作者设计了一种针对CD47和PD-L1的亲和调节双特异性抗体（BisAb），以拮抗固有和适应性免疫检查点通路。这种新型BisAb对PD-L1具有强大的亲和力，降低了对CD47的亲和力。
2. 实验结果
2.1 αCD47/PD-L1 BisAb的设计与特性分析
IC50：半抑制浓度(或称半抑制率) ， 在结合率为50%时所对应的抑制物质的浓度就叫做IC50。一般IC50的数值越小，说明抗体的特异性能越强。
EC50：引起50%个体有效的药物浓度，是药物安全性指标，通常其值越大越安全。
- （1）hBisAb的设计与筛选方案：αCD47/PD-L1 BisAb为一种全人源单抗（结构如图1A，筛选流程如图1B），重链结合臂基于噬菌体展示库技术发现。
- （2）hBisAb的特异性测试：基于细胞水平的亲和力测试，判定hBisAb对CD47亲和力（EC50=11.89nM），对PD-L1亲和力（EC50=0.32nM）（图1C-D）
- （3）hBisAb的安全性测试：与αCD47相比，对SIRPα存在中等强度的阻断能力（IC50=123.6nM）（如图1E）
- （4）hBisAb与现有PD-1药物特异性比较：与市面上的PD-1阻断剂atezolizumab, sasanilmab无显著差异（如图1F）
- （5）hBisAb对抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的影响：将人CD47+ PD-L1+肿瘤细胞和单核细胞来源的巨噬细胞进行了共培养试验，与αhCD47或αhPD-L1单药治疗相比，hBisAb诱导肿瘤细胞吞噬作用增加，不同IgG亚型（IgG1，IgG4）对肿瘤细胞吞噬也有影响。（如图1G）
- （6）hBisAb对DCs介导的T细胞活化的影响（混合淋巴细胞反应-MLR）：αhCD47治疗减少了白细胞介素2（IL-2）的分泌；αhPD-L1单药治疗及其与αhCD47联合治疗增加了IL-2的分泌；hBisAb显示IL-2和干扰素γ（IFNγ）分泌显著增加，表明hBisAb在增强DC介导的T细胞活化方面具有优越的能力（图1H）
2.2 αCD47/PD-L1 BisAb优先与肿瘤微环境中表达PD-L1的细胞结合，减少红细胞结合
实验设计 1 （体外试验）：BisAb与CD47+ PD-L1+人癌细胞系HT-1080、只表达CD47的人红细胞共培养（图2A）
- （1）hBisAb体外优先结合测试： 与αhCD47（5F9, 2A1）相比，hBisAb与红细胞（RBCs)的结合（EC50=7.37nM）减少了1500倍（图2B）
考虑到hBisAb无法直接用于小鼠做体内试验（无法实现小鼠CD47和PDL1同效率阻断），作者又生成了针对鼠源的αCD47/PD-L1（mBisAb），效率与hBisAb相当（如图C-D）
实验设计 2 （体内试验）：携带皮下B16F10肿瘤(免疫性冷肿瘤模型)的人FcγR小鼠在接种肿瘤后第13和16天注射人IgG同型的αmCD47、αmPD-L1、mBisAb，在第18天采集血液和肿瘤组织，小鼠体内的治疗性抗体结合细胞的状况通过流式细胞术使用抗人源IgG二抗检测
- （2）mBisAb体内优先结合测试： αmCD47会结合大量的红细胞而非肿瘤相关细胞；αmPD-L1同时结合肿瘤及其微环境中的相关细胞；与αmCD47相比，mBisAb显著降低对血液红细胞的结合，同时对肿瘤细胞和TILs的结合均显著增加；与αmPD-L1相比，mBisAb表现出与肿瘤细胞的结合增强
2.3 αCD47/PD-L1 BisAb与αCD47和αPD-L1联合使用相比有更好的治疗效果
实验设计 1： BALB/c小鼠CT26皮下移植（第0，3，7天注射抗体）：组1-同型抗体（对照组） 5mg/kg；组2-αmCD47 5mg/kg；组3-αmPD-L1 5mg/kg；组4-αmCD47 5mg/kg + αmPD-L1 5mg/kg；组5-mBisAb 5mg/kg；组6-mBisAb Fc-null 5mg/kg
（1）mBisAb具有更强的肿瘤生长抑制作用：mBisAb比单独使用αmCD47或αmPD-L1抗体表现出更强的肿瘤生长抑制作用；IgG效应功能在mBisAb介导的治疗效果中发挥了作用（与野生型Fc的mBisAb相比，没有Fc版本的mBisAb表现出更低的肿瘤生长抑制）；mbisab治疗组队列的生存率（75%）与其余5组相比显著改善--参考图3A-C
（2）CD47靶向治疗对血液红细胞的影响：在单独使用αmCD47和与αmPD-L1联合治疗的队列中，小鼠红细胞的数量显著减少；而对照组和mBisAb没有显著差异，说明双特异性靶向方法提高了抗肿瘤疗效，并降低了潜在的毒性作用。（图3D）
实验设计 2：C57/Bl6小鼠B16F10（免疫性冷肿瘤模型）皮下移植，在植入肿瘤细胞后第9天，雌性C57/Bl6荷肿瘤小鼠接受两种抗体治疗（Isotype, mBisAb）。治疗抗体剂量为20mg/kg（一周3次，注射3周）
（3）mBisAb在冷肿瘤模型同样有效： mBisAb相比于同型对照显著控制了肿瘤体积（图3E）
实验设计 3：C57BL/6小鼠MC38皮下移植后7天开始接收抗体治疗（every 3–4days for 3weeks）。剂量梯度：10，20，40mg/kg
（4）mBisAb在肿瘤治疗中存在剂量效应： 一定程度得加大mBisAb剂量能够更有效得控制肿瘤体积扩增（图3F）
实验设计 4：在MC38荷瘤小鼠中进行基于抗体的免疫细胞消耗研究，设置5组实验组（mBisAb同型对照，mBisAb，mBisAb+αCD8，mBisAb+αCD4，mBisAb+αCD8/4；mBisAb+αNK1.1，mBisAb+αCSF1R）
（5）CD8+细胞在mBisAb抗肿瘤调节中起到关键作用： 去除CD8+ 细胞后，就消除了mBisAb的抗肿瘤作用（图3G），单独消耗掉CD4+细胞、NK细胞、巨噬细胞都不影响mBisAb发挥作用（图3G-I）
实验设计 5：设置两组MC38荷瘤小鼠（WT，Batf3-/-），BATF3已被证明可以调节CD8 T细胞记忆的产生
（6）CD8+记忆T细胞可能是mBisAb抑制肿瘤增殖的关键细胞群： mBisAb介导的Batf3-/-小鼠的肿瘤生长抑制被消除（图3J），虽然在该模型不能排除BATF3缺失对T细胞的影响，但是考虑到靶向CD47的免疫调节通路依赖树突状细胞介导，因此后续将细胞类型聚焦在 CD8+ T细胞 和 树突状细胞。
2.4 αCD47/PD-L1 BisAb治疗诱导了体内强大的系统性CD8+ T细胞反应和肿瘤内CD8+ T细胞增殖
实验设计 1： MC38肿瘤模型小鼠在植入肿瘤10天后，每3-4天用同型（对照）或mBisAb治疗肿瘤移植小鼠，在第15、20、25天收集肿瘤和脾脏，用质谱流式进行分析和RNA-seq（Nanostring）
（1）mBisAb治疗组中激活的效应CD8+ T细胞在脾脏显著富集：在肿瘤接种第20天，具有激活表型的CD8+ T细胞（CD44hi、CD62Llo、CX3CR1+、KLRG1+、T-bet+、Eomes+）于mBisAb治疗组显著富集（参考图4A-B）；CD8+细胞中的效应T细胞（marker: CX3CR1, KLRG1）在肿瘤接种后第20天成比例增加，第25天仍然高于对照组（图4C-D）
（2）mBisAb促进脾脏中迁移性cDC1的积累和系统性T细胞反应：在mBisAb处理的小鼠的脾脏中，cDC1中CD103+细胞的比例增加（图4补充-C）；在mBisAb处理的小鼠血清中几种促炎介质水平升高：其中包括支持CD8+ T细胞启动和激活的关键细胞因子（IL-1β、IL-12和IL-18），以及关键的T细胞效应细胞因子IFNγ（补充表格2，在此未展示）。以上数据结果都与图3G,J的预测吻合。
（3）mBisAb促进肿瘤组织中CD8+ T细胞/Treg比值显著增加：mBisAb治疗组中CD8+ T细胞比例较高，Treg比例相对较低（图4E，F）。这导致mbisab治疗的肿瘤中CD8+ T细胞/Treg比值显著增加，而αmCD47或αmPD-L1治疗的肿瘤中没有增加（图4补充D-E），这一指标与有效的抗肿瘤反应和良好的预后相关。
（4）RNA-seq揭示mBisAb增强肿瘤内CD8+ T细胞反应的机制：mBisAb治疗组的肿瘤组织呈现出与CD8+ T细胞效应功能相关和抗原加工相关的基因高表达（图4I,J）；关键的T细胞招募趋化因子（Cxcl9、Cxcl10和Ccl5）的水平同样升高（图K-M），这表明 mBisAb可以通过增强CD8+ T细胞进入肿瘤的募集和增强肿瘤抗原的呈递来增强肿瘤内CD8+ T细胞的反应。
2.5 αCD47/PD-L1 BisAb治疗调整髓系群体基因表达，并驱动TME中的固有免疫激活
实验设计 1： MC38肿瘤模型小鼠在植入肿瘤10天后，每3-4天设置不同治疗组（组1-同型对照，组2-mBisAb治疗，组3-αmCD47单独、组4-αmPD-L1单独或组5-αmPD-L1和αmCD47联合治疗）肿瘤移植小鼠，第20天采集肿瘤和脾脏进行bulk-RNA-seq分析和scRNA-seq分析
（1）mBisAb治疗的肿瘤中显著富集固有免疫激活相关基因：（基于RNA-seq数据）I型IFN信号通路，模式识别受体（PRR）介导的IFNα诱导通路，FcγR依赖性吞噬作用相关基因显著在mBisAb治疗组富集（图5A,B）。通过通路相关网络分析，与αmCD47和αmPD-L1联合治疗相比，一些与先天免疫感知相关的通路（包括toll样受体介导的信号通路），在mBisAb治疗后上调的基因中特异性富集（在补充图表，本文未提供）。因此，双特异性靶向方法对TME有明显的影响，而这不能通过通过单独的CD47和PD-L1抗体阻断来再现。
（2）巨噬细胞亚群细分：无监督聚类确定了6个单核细胞和巨噬细胞群体（图5C），其中差异基因表达分析显示了区分这些聚类的基因特征（图5D）。拟时序分析发现cluster5包含经典和非经典单核细胞群，其他cluster可能代表单核来源的细胞（图5E）。cluster1 表现出未成熟单核细胞基因（Ly6c2，Ccr2）以及成熟标记物（Itgax，Cx3cr1）的共表达；cluster 2和cluster 4 被鉴定为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）群体，其特征是成熟巨噬细胞（Vcam1、Mertk、Apoe）和增殖巨噬细胞（Top2a、Mki67）的标记物。cluster3 明显富含血管生成和炎症标志物（Vegfa，Nos2，Mmp12）；cluster6 细胞表现出与免疫抑制相关的典型标记物（Mrc1，Cd200r1）的表达
（3）mBisAb治疗组TAM群体表现出与抗原加工和呈递相关的基因的相对表达增加：虽然治疗后髓系cluster的相对细胞比例没有显著变化，但在这些治疗组中观察到明显的基因表达变化：在mBisAb治疗后，TAM群体表现出与抗原加工和呈递相关的基因的相对表达增加，并伴随着与细胞周期和增殖相关的基因表达的减少（图5F）；GO通路富集分析比较了mBisAb与对照治疗的肿瘤，进一步说明了mBisAb治疗组在多个髓系群体中与抗原呈递、IFN反应和补体激活相关的基因的上调（图5G）
（4）树突状细胞亚群细分：无监督聚类显示了传统树突状细胞的三个亚群（cDC1、cDC2和mregDC24）（图5H），其中差异基因表达分析显示了区分这些聚类的基因特征（图5I）
（5）mBisAb治疗组主要诱导cDC2和mregDC表达变化：mBisAb处理诱导的基因表达变化与αmCD47和αmPD-L1联合处理诱导的基因表达变化相似（图5J），但是仅在mBisAb处理的cDC2亚群中观察到与DC分化、对II型IFN的反应以及抗原加工和呈递相关的基因的相对表达增加(图5K）；同时与其他处理相比，mBisAb给药诱导的基因表达变化主要与mregDC亚群内的翻译调控有关（在补充图表，本文未提供）
2.6 αCD47/PD-L1 BisAb治疗增加了肿瘤中干细胞样祖细胞和效应CD8+ T细胞亚群比例，并促进了CD8+ T祖细胞分化为效应样状态
实验设计如2.5 利用scRNA-seq数据集来进一步了解mBisAb治疗如何影响TME内的CD8+ T细胞
（1）肿瘤CD8+ T细胞亚群细分：鉴定了6个不同的肿瘤内CD8+ T细胞簇（图6A），确定了每个cluster相对于所有其他肿瘤内CD8+ T细胞簇有差异表达的基因（图6B）；cluster 1为干细胞样祖细胞样CD8+ T细胞 （转录因子Tcf7和趋化因子受体Cxcr3高表达），这一群体已被证明在维持有效的抗肿瘤T细胞反应中发挥了关键作用，并与改善对检查点封锁治疗的反应性相关；cluster2为末端耗尽T细胞 （Cd244和Ptpn6的表达相对较高），同时高表达T细胞衰竭相关基因（Pdcd1和Havcr2）；cluster3 虽然也高表达T细胞衰竭相关基因，但CD8+ T细胞效应功能相关基因同样高表达，包括IfngPrf1（编码穿孔素），在促进DC和巨噬细胞招募，成熟和激活起重要作用的趋化因子（Ccl4和Ccl3），和Cx3cr1（慢病毒感染后存在高效应功能的T细胞marker）。
（2）mBisAb治疗组cluster1和3显著富集：值得注意的是，与αCD47和αPD-L1单治疗或联合治疗相比，mBisAb治疗特异性增加了cluster1干样祖细胞和cluster3效应样CD8+ T细胞的比例（图6C）
（3）CD8+ T细胞cluster1在不同治疗组差异表达：在mBisAb治疗后，CD8+ T细胞cluster1下调的特定基因包括与幼稚T细胞状态相关的基因，如转录因子Tcf7、Lef1和Bach2；上调的基因包括与效应CD8 T细胞功能和命运相关的基因，如颗粒酶（Gzmb，Gzmk）、免疫细胞招募趋化因子（Ccl5）和转录因子Tbx21和Id2（图6D）。差异表达基因的GO富集分析发现，除αmCD47治疗组之外，其余3种治疗方式（αmPDL1，αmPDL1+αmCD47联合，mBisAb）的cluster1高表达基因显著富集在T细胞分化和效应功能通路，包括细胞对IFNγ的反应，细胞溶解和T细胞介导的细胞毒性；而以下通路仅显著富集在mBisAb治疗组（调节T细胞的激活，正向调节TNF的产生，正向调节I型IFN介导的信号转导）（图6E）
（4）mBisAb治疗扩大了具有高效应潜能的细胞群体：mBisAb治疗诱导CD8+ T细胞从幼稚状态到效应状态的分化相关途径的基因表达富集（图6F），mBisAb治疗比αmCD47或αmPD-L1单药治疗及其联合治疗更能诱导这一结果
（5）脾脏CD8+ T细胞亚群细分： 在脾脏内发现了四种不同的CD8+ T细胞簇，为了阐明每个cluster的细胞类型，确定了每个聚类相对于所有其他脾脏CD8+ T细胞簇的差异表达的基因(图6G）；cluster 1 幼稚T细胞（Lef1、Tcf7、Sell和Il7r）；cluster 2 记忆T细胞（Cd44、Ly6c2、Eomes和Il2rb）；cluster 3 增殖T细胞（Mki67和Top2a）；cluster4 效应T细胞，包括关键谱系定义转录因子（Tbx21、Zeb2和Id2）、效应分子（Gzma、Gzmb、Gzmk）和趋化因子受体（Ccr5、Cxcr3、Cx3cr1）高表达
（6）mBisAb治疗诱导了强大的系统性和肿瘤内的T细胞反应：除αmCD47治疗组之外，其余治疗组与对照相比显著提高了增殖T细胞和效应T细胞的比例；mBisAb治疗组脾脏CD8+ T细胞增殖效应显著高于PD-L1治疗组，这些数据与CyTOF和流式细胞术数据一致（图6H）
2.7 αCD47/PD-L1 BisAb可同时调节食蟹猴的固有免疫和适应性免疫
实验设计 1： 旨在探索hBisAb的毒性谱和潜在的药效学标志物
食蟹猴 每周静脉注射10、30或100mg/kg的hBisAb，持续2周（设置vehicle注射作为对照），多个时间点收集外周血样本用于RNA-seq分析
（1）指定剂量的hBisAb对NHP没有显著副作用：在2周的给药期间，红细胞和血小板的细胞量保持在历史对照的范围内，没有发现不利影响（图7A，B）
（2）hBisAb可以显著提升NHP血液中T细胞比例：给药hBisAb后的NHPs显示CD25+ CD8+ T细胞（图7C）和CD69+ CD4+ T细胞（图7D）显著增加。
（3）hBisAb显著富集NHP的固有免疫激活相关途径基因：hBisAb处理增加了I型IFN信号通路（STAT1、BATF2、IRF7、RSAD2、IFIT3）和髓系细胞激活（CD80、MX1、TMEM173、DDX58）相关基因的表达(图7E）；IFN信号和PRR介导的固有免疫反应是hBisAb治疗组中富集强度最高的通路(图7F）；在所有免疫亚群中，活化的树突状细胞和M1巨噬细胞表型是hbisab处理的样本中相对于对照载体最丰富的基因特征（图7G，H）；这些数据与小鼠模型中的TME数据一致，也有临床数据证明，固有免疫调节，特别是I型IFN反应，使肿瘤对当前的免疫检查点抑制剂敏感。
（4）hBisAb治疗诱导了NHP体内强大的系统性和T细胞反应：：许多与T细胞激活相关的基因（CD28、ICOS、LAG3、CTLA4）和细胞迁移（CXCL10、CCR7）相关的基因在hBisAb治疗组中富集(图7E）
实验设计 2： 构建抗体hBisAb2（CD47亲和力降低）；食蟹猴 每周静脉注射hBisAb和hBisAb2，收集外周血样本用于RNA-seq分析
（5）CD47臂是hBisAb诱导强大的固有免疫激活的主要驱动因素：hBisAb处理的样本中与I型IFN信号通路和髓系细胞激活相关的通路明显富集（图7I）；hBisAb诱导了几个关键的固有免疫调节基因的上调，而这些基因并未随hBisAb2诱导显著上调（图7J）。
3. 亮点总结
（1）设计中等亲和力的CD47和高亲和力的PD-L1的双特异性，与外周血相比显著提高了抗体对TME的选择性
（2） 在同基因肿瘤模型中，双特异性治疗比αCD47、αPD-L1单药治疗产生了更有利的治疗窗口
（3）在小鼠和NHP系统中发现了双特异性治疗后独特的髓系和T细胞激活模式，证明了其能够参与固有免疫和适应性免疫应答以获得抗肿瘤疗效