慢病毒载体（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因（或 RNAi ）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链 RNA ，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA ，形成 DNA 整合前复合体，进入细胞核后， DNA 整合到细胞基因组中。整合后的 DNA 转录mRNA ，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生 RNAi 干扰。慢病毒载体介导的基因表达或 RNAi 干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。慢病毒载体不表达任何 HIV-1 蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第 2 次注射。
1构建质粒
2质粒DNA在大肠杆菌中转化
2.1大肠杆菌感受态细胞的制备
1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h
3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min
4）4℃离心10min（4000r/min）
5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽
6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min
7）4℃离心10min（4000r/min）
8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）
9）分装细胞，200ul一份，4℃保存
2.2质粒DNA的转化
1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min
2）离心管放到42℃保温90s
3）冰浴2min
4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）
5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min
6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落
3.质粒提取步骤（试剂盒）
1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清
2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。
3）加入250ul溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。
5）12000室温离心10min，收集上清。6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
7）12000转离心1min，弃滤液。
8）加入500ul溶液PB（洗涤液）
12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。
10）12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，PH为8.0-8.5），室温放置2min。
12）12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质粒于-20℃保存。
4、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）
第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度
第二天：
1. 500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G
2. 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体2000
3. 5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min
4. 从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。
5. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB
（从此刻开始算时间）。
第三天：
1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上
第四天：
1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。
2.3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。
3.12000转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存。
4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
4.3病毒包装的原理
质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。
5病毒感染细胞
感染步骤
1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜
2）感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。
3) 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。
荧光显微镜的操作流程
打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。（针对leica）
注意事项内容
1.病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。
2.感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度，在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基。
3.在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。
4.在加病毒后一般24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体时间根据细胞状态来看。
6、感染后的细胞检测方法
6.1荧光初步检测若有荧光，则表示病毒感染成功，但并不能确定目的基因是否整合到细胞中，待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。
6.2RNA的提取及RT-PCR检测
6.3蛋白提取及Western检测