科研实验成功指南 | 低浓度质粒真的包不好慢病毒吗？

今天要记录一个很实用的实验技巧：如题，怎么利用低浓度的质粒包好慢病毒吗？

慢病毒已经成为目前生命科学领域一个很常用的进行基因表达调控的实验方法了。目前也很多公司商业化包装能达到很好的效果，但是公司流程化需要的试验周期比较长，有的时候着急用，或者只是想做个前期摸索实验，这时候再交由公司做不免浪费钱也耗费时间，所以自己最好还是也要会包装慢病毒。

一些常规的慢病毒相关的知识我就不重复了。参考：慢病毒包装实验so easy！详细步骤及滴度测定看过来！

详细如上述链接，以及我们可能也听到过这么一句话：进行转染的质粒浓度最好是≥500ng/uL，不然转染效果一般都不好。
一般来说，实验结果也确实如此。

                             **【实验记录如下】**

第一次实验：

1. 预计用三质粒系统进行慢病毒包装，分别是pCDH-CAG-3HA-EGFP-T2A-PURO, psPAX2和pMD2.G。设计使用的质粒比例pCDH-CAG-EGFP-PURO : psPAX2 : pMD2.G = 4:3:1。
   一个10mm2培养皿的HEK293T细胞（~70%-90%汇合度），使用总共25微克质粒，即12.5ug pCDH-CAG-EGFP-PURO, 9.375ug psPAX2和3.125ug pMD2.G。

2. 转染试剂准备
   使用的转染试剂为ThermoFisher的lipo3000平替——聚合美mf138-02（也是lipo3000，组分和使用完全一样）。
   Reagent A: 625 uL Opti-MEM + 18.75 uL （准备4份）
   Reagent B: 625 uL Opti-MEM + plasmids + 25 uLP3000
   · 质粒使用如下：
   psPAX2: 496 ng/uL, 取18.9 uL/rnx；
   pMD2.G: 526.98 ng/uL，取5.93 uL/rnx；
   plasmid-1: 147.9 ng/uL，取84.5 uL；
   plasmid-2: 189.68 ng/uL, 取65.9 uL；
   plasmid-3: 74.4 ng/uL, 取168 uL；
   plasmid-4: 235.9 ng/uL, 取53 uL。
   混匀后，A，B各自室温孵育5分钟，之后将Reagent-A加入到Reagent-B中，轻轻吹打混匀，室温孵育20分钟。

3. 实验结果
   转染后48小时和72小时分别在荧光显微镜下观看绿色荧光情况，结果plasmid4的荧光最亮，大约是85%以上的细胞带有GFP+，其次是plasmid-1，大约60%细胞呈GFP+， plasmid-2和plasmid-3的荧光非常弱，大约只有20%左右的细胞带有GFP+
   我不死心，收取了各10mL上清（48-72小时之间）并利用PEG8000-NaCl溶液过夜沉淀后4000xg,4℃离心20分钟的方法进行了慢病毒的浓缩，并使用浓缩后的慢病毒进行HEK293T细胞的感染（病毒滴度粗滴定），结果还是和转染时一样，这个阳性率得到的病毒显然是无法高效满足实验需求的。

原因分析&第二次实验
我在想真的是质粒的原因吗？想到重新转化和质粒大提真的很烦。。。偷懒使人进步，
我首先想是不是因为plasmid的插入片段长度不一样导致在实际转染使用的质粒量上需要调整，而不能都一致用12.5ug， 结果由于plasmid-4和plasmid-3的长度是一样的但是结果不一样，我推翻了这个猜想。
后来我重新思考lipo3000质粒转染的原理：lipo3000转染试剂其本质是一种阳离子脂质体。它的作用原理是借鉴了liposome脂质体包裹质粒DNA，通过生物膜融合原理将质粒DNA递送进哺乳动物细胞这一生物学现象，利用带正电的阳离子脂质体来结合带负电的质粒DNA，形成DNA-脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，再经内吞作用导入细胞。（要是我说错了请指正不要杠我）
于是我突然灵光一现想到，会不会是由于质粒浓度不一致导致的使用体积的不一致引起的慢病毒包装失败呢？（即是否需要根据reagent-B的总体积来调整reagent-A的用量？）
于是我开始了我第二次实验：
Reagent-A：不变，但是准备5份 Reagent-B：不变 A和B的混合根据B的总体积进行调整，取与Reagent-B差不多的体积进行混合孵育，再转染。
48小时后在荧光显微镜下观察荧光，结果表明，所有质粒组的HEK293T细胞都有90%+以上呈现GFP+。
细胞无明显死亡和掉落。
成功了！！！

慢病毒高效包装

当然如果想进行浓缩，按照分子克隆的操作即可：

质粒浓缩

这个是本人进行过的成功操作，大概得率如下：
74.4 ng/uL的质粒1毫升，最后浓缩为704.6 ng/uL，58微升；
147.9 ng/uL的质粒1.2毫升，最后浓缩905 ng/uL，168微升。

更新：实操可行的慢病毒浓缩方法（没有超速离心怎么浓缩慢病毒？）

PEG法浓缩慢病毒

慢病毒感染踩坑——病毒浓度过高会导致细胞死亡，但是又想偷懒的话就多做几个梯度的病毒进行感染，保证一次就能拿到感染成果的细胞！！！

另外！！！
慢病毒实验请在二级生物安全柜操作！！！！如果只能在超净台操作，切勿开通风！！！！珍爱自己的生命！！！！！
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Tips2:

Don't hesitate to use a larger volume of Lipo3000!!!! And Invitrogin lipo3000 alway more stable than any of domestic products!!!