CoIP结果查看

CoIP的原理图

image

文献信息:

Abe, T., et al. (2017). "Germ-Cell-Specific Inflammasome Component NLRP14 Negatively Regulates Cytosolic Nucleic Acid Sensing to Promote Fertilization." Immunity 46(4): 621-634.

文献截图

image

先看一下图中的缩写:

IP全称是immunoprecipitation,即免疫沉淀,这一步主要是为了纯化目的蛋白。

IB全称是immunoblotting,即免疫印迹,也就是常规的Western Blotting,用于显示目的蛋白。

WCL全称是whole cell lysates,即整个细胞的裂解成分。

HC全称是heavy chain,即重链,

LC全称是light chain,即轻链。

结果查看

将图分为三部分,先看第一部分,即上面的部分,“+”表示含有这种蛋白,“-”表示没有,这个实验一共做了四组,从左到右分别为:①只表达HA-cGAS的293T细胞;②共同表达HA-cGAS与NRLP14-FL的293T细胞;③只表达STING-HA的293T细胞;④共同表达STING-HA与与NRLP14-FL的293T细胞,如下所示:

image

再看第二部分WB的图,WB的图就是使用含有FLAG抗体的珠子拉下来的蛋白做的,使用拉下来的这些蛋白再做WB,它的原理前面已经描述过了。使用FLAG抗体的珠子拉下来的蛋白使用HA抗体来进行检测,其结果如下:

image

从上面的图像可以看出以下信息:

第一, HC与LC条带都非常明显,之所以出现这个条件是因为,在WB之前进行的蛋白变性这一步,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇,巯基乙醇会把抗体的重链和轻链之间的二硫键破坏,从而使的抗体变成重链分子55KD和轻链分子25KD,因此会在结果中呈现两个条带。

第二, 第一组(只表达HA-cGAS的293T细胞)中没有条带,第二组(共同表达HA-cGAS与NRLP14-FL的293T细胞)没有条带,第三组(只表达STING-HA的293T细胞)有一点点条带,第四组(共同表达STING-HA与与NRLP14-FL的293T细胞)条带明显,这说明NLRP14与STING有相互作用,为什么说有相互作用呢?因为我们是用FLAG抗体来拉的蛋白,从理论上讲,我们只能拉下FLAG标记的NLRP14,也就是NLRP14-FL(FL就是FLAG),但是,从拉下的蛋白中用HA进行检测,居然检测出来了HA标记的STING,这就说明,使用FLAG拉NLRP14-FL时,这个蛋白复合物中含有STING-HA。

再看图的第三部分,也就是下面的这一部分,是用FLAG抗体和HA抗体来进行检测整个细胞的裂解液,是作为阳性对照(有的文献中会标明input组),如下所示:

image

其中右侧的WCL表示的是整个细胞的裂解液,也就是还没有使用FLAG抗体的珠子去拉的时候的样本,也就是说直接裂解了293T细胞后的样本,从这个结果中可以得到以下信息:

第一, 在使用FLAG抗体进行检测全蛋白时,相当于阳性对照。第一组(只表达HA-cGAS的293T细胞)中没有条带,因为这种293T细胞中只有HA标记的cGAS,第二组(共同表达HA-cGAS与NLRP14-FL的293T细胞)有条带,因为FLAG抗体能检测出使用了FLAG标记的NLRP14,NLRP14的蛋白分子量大概是125kD,第三组(只表达STING-HA的293T细胞)没有条带,因此这种293T细胞只表达HA标记的STING;第四组(共同表达STING-HA与与NLRP14-FL的293T细胞)条带明显,因为这个细胞中含有FLAG标记的NLRP14。

第二, 使用HA抗体检测全蛋白,这是阳性对照,是说明细胞中含有相应的蛋白。我们可以发现,第一组(只表达HA-cGAS的293T细胞)在27kD附近没有条件,在50kD部分有条带,这说明,全蛋白中含有HA标记的cGAS(cGAS的蛋白分子量是62kD,多数蛋白标签的分子量很少,基本可以忽略),做这个实验主要是作为阳性对照;第二组(共同表达HA-cGAS与NLRP14-FL的293T细胞)在37kD附近没有条带,在50kD附近有条带;结合前面的结果来看,就说明这个细胞中含有HA标记的cGAS(因为它的分子量大概是50kD),还含有FALG标记的NLRP14(因为NLRP14的蛋白分子量大概是125kD);第三组(只表达STING-HA的293T细胞)在37kD处有条带,这说明细胞中含有HA标记的STING(因为STING的分子量大概是35kD);第四组(共同表达STING-HA与与NLRP14-FL的293T细胞)在110kD处有条带,在37kD处也有条带,这说明这种细胞中含有NLRP14与STING。

从上面的图片可以知道,在做Co-IP实验时。需要设立阳性对照组来证明你的细胞中有某个蛋白A与B,再使用抗蛋白A的抗体来拉A蛋白,再使用抗蛋白B的抗体来检测拉下来的蛋白,如果检测到了蛋白B,就说明蛋白A与蛋白B有相互作用。

你可能感兴趣的:(CoIP结果查看)