根据barcode拆分测序数据

扩增子测序不同于其他高通量测序项目，扩增子测序往往样品量较大，但单个样品的数据量要求不高（因为仅仅研究扩增区域的序列）。为了节约成本，研究者们通常会把多个样品混在一个文库，并给不同样品加上一段 Barcode 序列。在后续的生物信息分析中，根据 Barcode 序列即可将不同样品的序列拆分开来。接下来介绍两个序列拆分工具

seqtk_demultiplex 和 fastq-multx。

seqtk_demultiplex

seqtk_demultiplex 安装

wget https://github.com/jameslz/fastx-utils/raw/master/seqtk_demultiplex

# seqtk_demultiplex 要求GLIBC_2.14版本

wget http://ftp.gnu.org/gnu/glibc/glibc-2.14.tar.gz

mv glibc-2.14.tar.gz /opt/sysoft

cd /opt/sysoft

tar zxvf glibc-2.14.tar.gz

cd glibc-2.14

mkdir build

cd build

../configure --prefix=/sysoft/glibc-2.14

make -j4

make install

cp /opt/sysoftglibc-2.14/lib/libc-2.14.so /lib64/

cd /lib64

mv libc.so.6 libc.so.6.back

# 报错不用管 error while loading shared libraries: libc.so.6: cannot open shared object file: No such file or directory

/sbin/sln libc-2.14.so /lib64/libc.so.6

#查看支持版本

strings /lib64/libc.so.6 |grep GLIBC

# en_US.UTF-8报错

echo "LANG=en_US.utf-8\nLC_ALL=en_US.utf-8" > /etc/environment

source /etc/environment

localedef -v -c -i en_US -f UTF-8 en_US.UTF-8

seqtk_demultiplex 参数

-1, 测序正向fastq序列，fastq文件，支持gz压缩文件

-2, 测序反向fastq序列，支持gz压缩文件

-b, barcode的文件

-d, 输入文件目录；

-l, barcode 序列长度（如长度大小不一致，填写最短的序列长度），默认5；

barcode 文件格式 (制表符分隔：共三列，第一列为样本名，第二列为正向barcode，第三列为反向barcode)

itaq1 ATCACG TCTAAT

itaq2 CGATGT TCTAAT

itaq3 TTAGGC TCTAAT

itaq4 TGACCA TCTAAT

itaq5 ACAGTG TCTAAT

itaq6 GCCAAT TCTAAT

itaq7 CAGATC TCTAAT

seqtk_demultiplex 使用

./seqtk_demultiplex -b barcode.txt -1 itaq.1.fastq -2 itaq.2.fastq -l 6 -d seqtk_output

# 因为桥式PCR测序过程中双端序列方向不一定一致，因此需要颠倒两测序文件进行二次拆分，具体参见fastq_multx操作

fastq-multx

seqtk_demultiplex 在拆分数据时无法设置 barcode 允许的错配碱基数，fastq-multx 中可以设置其参数。

fastq-multx 安装

git clone https://github.com/brwnj/fastq-multx

cd fastq-multx

make

fastq-multx 参数

-o, 输出文件，一个输入文件一个输出文件流，格式： %.R1.fq.gz， %为barcode对应的样本名

-m, barcod允许的主要错配个数，一般设置为0， 默认1

-B, barcode文件，允许单端和双端barcode

-n, 打印barcode序列

-b, 从序列的5'端碱基开始匹配barcode

-e, 从序列3'端开始匹配序列

-q, 控制barcode碱基的最小phred quality值，默认为0，不控制

-d, 控制匹配的最佳barcode位置和此佳barcode位置的位置，两个匹配距离不能超过2个碱基

barcode 文件格式 (制表符分隔：单端 barcode 只需要提供两列数据，双端 barcode 需要中间加上 ‘-”)

itaq1 ATCACG-TCTAAT

itaq2 CGATGT-TCTAAT

itaq3 TTAGGC-TCTAAT

itaq4 TGACCA-TCTAAT

itaq5 ACAGTG-TCTAAT

itaq6 GCCAAT-TCTAAT

itaq7 CAGATC-TCTAAT

fastq-multx 使用

mkdir fastq_multx_output-1

./fastq-multx/fastq-multx -B barcode.txt -m 1 -b itaq.1.fastq itaq.2.fastq -o %.R1.fastq -o %.R2.fastq

# 因为桥式PCR测序过程中双端序列方向不一定一致，因此需要颠倒两测序文件进行二次拆分

mkdir fastq_multx_output-2

./fastq-multx/fastq-multx -B barcode.txt -m 1 -b itaq.2.fastq itaq.1.fastq -o %.R1.fastq -o %.R2.fastq

# 合并两次拆分的结果

mkdir fastq_multx_output

for i in `ls fastq_multx_output-1/itaq*.R1.fastq`; do a=${i/.R1.fastq/}; a=${a/fastq_multx_output-1\//}; echo "$a"; done > sample.list

for i in `cat sample.list`; do echo "cat fastq_multx_output-1/$i.R1.fastq fastq_multx_output-2/$i.R2.fastq > ./fastq_multx_output/$i.R1.fastq"; done > command.combine.R1.list

for i in `cat sample.list`; do echo "cat fastq_multx_output-1/$i.R2.fastq fastq_multx_output-2/$i.R1.fastq > ./fastq_multx_output/$i.R2.fastq"; done > command.combine.R2.list

sh command.combine.R1.list

sh command.combine.R2.list

fastq-multx 操作方便，但是反向序列的barcode没有被切除，需要后续进一步处理。

参考：

http://www.zhengyue90.com/?p=249