hello，大家好，今天我们来继续分享10X单细胞和10X空间转录组联合分析解析疾病机制的研究，相信大家都已经看到了，转录组的时空表达越来越成为生物学研究的利器，参考的文章在NLRP3 Inflammasome Mediates Immune-Stromal Interactions in Vasculitis，2021年10月发表于Circulation Research，影响因子17分，我们来看看这篇文章带给我们什么新的分析角度。
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基本原理：NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3)激活和 IL-1β（白介素-1β）产生与川崎病 (KD) 发病机制有关； 然而，仍然缺乏对参与心血管病变发展的molecular networks和细胞亚群的详细和完整的表征。
研究目的：在这里，在 KD 血管炎的小鼠模型中，使用单细胞 RNA 测序和空间转录组学来确定发炎血管组织的细胞landscape。
方法和结果：研究观察了与 Nlrp3 和 Il1b 表达增加相关的小鼠 KD 心血管病变中先天性和适应性免疫细胞的浸润。 单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞是 IL-1β 的主要来源，而成纤维细胞和血管平滑肌细胞 (VSMC) 表达高水平的 IL-1 受体。 发炎冠状动脉周围的 1 型 VSMC undergo表型转换成为 2 型 VSMC，其特征在于与decreased contraction and enhanced migration and proliferation。 VSMCs 上 IL-1β 信号的遗传抑制有效地减弱了 VSMCs 2 型表型转换和小鼠 KD 血管炎期间心血管病变的发展。 此外，NLRP3 的药理抑制可防止心血管炎症的发展。
结论：研究揭示了与鼠 KD 心血管病变中 IL-1β 产生和信号传导有关的细胞多样性，并为靶向 NLRP3 以抑制与 KD 相关的心血管病变的治疗策略提供了理论依据。
Introduction
川崎病 (Kawasaki disease，KD) 是一种影响婴幼儿的急性发热性和全身性血管炎，在高达 25% 的未治疗病例中会导致冠状动脉瘤 (CAA)。大剂量静脉注射免疫球蛋白 (IVIG) 治疗显着降低了这一结果； 然而，多达 20% 的受影响儿童对 IVIG 治疗没有反应，并且患 CAA 的风险增加。IVIG 降低发病率和预防 CAA 的确切机制，以及为什么一些儿童会产生 IVIG 耐药性仍不清楚 . 对来自 KD 患者解剖的人体样本的免疫组织化学分析表明，从中性粒细胞和单核细胞到 CD8+ T 细胞和 IgA 浆母细胞，各种各样的先天性和适应性免疫细胞浸润并积聚在冠状动脉壁中。 这些细胞浸润与促炎细胞因子circulating concentrations增加有关，例如 IL-1β（白介素-1β）和 TNF（肿瘤坏死因子）-α； 然而，这些细胞因子促进血管炎症和 CAA 发展的具体机制仍未确定。
IL-1β 的产生受到 NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3)）炎性体的严格调控，炎性体是一种多蛋白复合物，在细胞内 NLRP3 感知病原体衍生、环境或内源性危险信号后被激活和组装。 一旦被激活，寡聚化的 NLRP3 就会募集含有半胱天冬酶募集结构域 (ASC) 的接头蛋白凋亡相关speck-like蛋白。 组装的 ASC 反过来与 Caspase-1 相互作用并激活 Caspase-1 以形成炎性体。Caspase-1 的激活导致 pro-IL-1β 和 pro-IL-18 裂解为成熟和功能形式。通过免疫细胞的募集 和激活关键免疫通路，IL-1β 对于宿主防御感染至关重要。 然而，不受控制和失调的 IL-1β 产生与多种炎症性疾病的发展有关。
在急性 KD 中，患者表现出循环 IL-1β 和 IL-18 浓度升高，随后通过 IVIG 治疗降低。与 IL-1 信号通路相关的基因表达增加与急性 KD 和 IVIG 耐药相关。单核苷酸介导 NLRP3 炎症小体激活的肌醇 1,4,5-三磷酸 3 激酶 (ITPKC) 基因的多态性与急性 KD、CAA 和 IVIG 抗性相关。此外，IL1B 基因中的单核苷酸多态性与冠状动脉病变和 IVIG 抗性的发展。使用 IL-1 受体拮抗剂阿那白滞素阻断 IL-1 通路可有效治疗 IVIG 耐药 KD 患者。同时新出现的数据也表明，长期抑制 IL-1β 可能显着增加感染风险，尤其是侵袭性A 组链球菌，阿那白滞素是 KD 的短期治疗方法，感染风险的增加可能不是特别关注的问题。然而，用小分子抑制剂直接靶向 NLRP3 可能通过阻断 IL-1β 和 IL-18 的产生为 KD 治疗提供额外的优势。
为了为 IVIG 耐药 KD 儿童设计适当的治疗干预措施，迫切需要在单细胞水平上更好地表征参与病理性 KD 免疫反应的细胞和分子改变。 在这里，研究对来自健康对照 (HC)、急性和恢复期 IVIG 治疗的 KD 患者的公开可用转录组学数据集进行分析和细胞解卷积，并揭示循环先天免疫细胞的比例增加以及与 NLRP3-IL-1β 相关的转录本表达升高 during acute KD。 使用充分描述和接受的干酪乳杆菌细胞壁提取物 (LCWE) 小鼠 KD 血管炎模型，我们发现 NLRP3 的药理学抑制可防止血管组织炎症的发展。此外，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）在稳态和 LCWE 诱导的 KD 血管炎期间产生了血管组织的全面细胞图谱，揭示了不同免疫细胞在空间上发炎的血管中有组织和密集的浸润。这种浸润由巨噬细胞、单核细胞和树突细胞 (DC) 组成，它们表达高水平的 NLRP3-IL-1β 通路转录物。在心血管病变中，观察到血管平滑肌细胞 (VSMCs) 1 型到 VSMCs 2 型的表型转换，它们具有纤维肌细胞和合成 VSMCs 的特性，并显示收缩蛋白的表达减少，成纤维细胞标志物的表达增加，MMPs（基质）金属蛋白酶）、炎症和增殖标志物。这些 2 型 VSMC 围绕浸润的先天免疫细胞的核心产生 IL-1β，并表达高水平的 IL-1 受体 (IL-1R) 转录物。 VSMCs 上 IL-1β 信号的可诱导基因缺失减弱了 VSMCs 2 型表型转换，并显着降低了 LCWE 诱导的心血管病变的发展。因此，研究确定了在鼠 KD 发炎的血管组织中参与 IL-1β 产生和信号传导的细胞亚群，并为靶向 NLRP3 以抑制与 KD 相关的心血管病变提供了基本原理。
RESULTS
Increased Expression of IL1B and NLRP3-Related Genes During Human KD
人类 KD 患者的转录组分析和遗传研究以及用 KD 实验鼠模型获得的结果表明 NLRP3 激活和 IL-1β 产生在 KD 发病机制中起核心作用 然而，产生或响应 IL-1β 的细胞亚群并涉及 在 KD 的发病机制中尚不清楚。首先生成了一个 IL-1β 基因特征，包括参与 IL-1β 产生（NLRP3、IL1B、CASP1、GSDMD 和 PYCARD）或 IL-1β 信号传导（MYD88、IL1R1 和 IL1RAP）的基因，并检查了它们在公开可用的表达（来自急性 KD 患者与 HC 或急性 KD 患者与恢复期 IVIG 治疗的 KD 患者血液的基因表达数据集）。与 HC 患者相比，急性 KD 患者中参与 IL-1β 产生或 IL-1 信号传导的特征基因的表达增加。
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- 注：Heatmaps illustrating the expression of genes involved either in IL-1β production (NLRP3, IL1B, CASP1, GSDMD, and PYCARD) or IL-1β signaling (MYD88, IL1R1, and IL1RAP) in blood from patients with acute KD compared with healthy control (HC) (GSE68004 and GSE73461) and patients with acute KD compared with convalescent KD patients (GSE63881). Color gradient represents expression relative to the mean of each row. Differential expression was analyzed with GEO2R and only genes of interest with an FDR <0.05 are represented.
重要的是，恢复期患者的KD resolution与这些 IL-1β 产生和信号基因特征的下调相关。 对显着差异表达基因的Ingenuity pathway analysis(IPA) 表明与炎症反应相关的多个经典通路上调，例如 IL-8 和 IL-6 信号传导、toll 样受体信号传导、急性期反应信号传导和炎症小体通路的上调（在急性 KD 患者中与 HC 或恢复期 KD 患者进行比较）。为了表征 KD 患者血液的相对细胞异质性，我们对公开可用的基因表达数据集进行了细胞去卷积分析 (CIBERSORT，bulk数据的解卷积分析也是当前研究的一个很好的方向)。
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- 注：CIBERSORT cell deconvolution analysis of gene expression from patients with acute KD compared with HC (GSE68004 and GSE73461) and acute KD compared with convalescent KD patients (GSE63881). The cell proportion of each column sums to 1. FDR indicates false discovery rate.
与 HC 和恢复期 KD 患者相比，急性 KD 患者表现出中性粒细胞和单核细胞数量增加。 总之，这些数据表明，在急性 KD 患者中，与 NLRP3 诱导的 IL-1β 产生和信号传导以及与中性粒细胞和单核细胞相关的基因表达相关的通路增加。
NLRP3 药理阻断可预防 LCWE 诱导的 KD 血管炎
在 KD 血管炎实验模型中阻断 IL-1 信号传导成功地阻止了心血管病变的发展，这导致了最近在 IVIG 耐药 KD 患者中使用阿那白滞素（一种 IL-1R 拮抗剂）的 2 期临床试验。此外，预防性中和 IL -18，与 IL-1β 一样，合成为需要 NLRP3 激活和由 Caspase-1 处理的无活性前体，减少了 LCWE 注射小鼠心血管病变的发展。
由于 IL-1β 和 IL-18 有助于 LCWE 诱导的 KD 血管炎的发展，并且都是 NLRP3 激活的产物，接下来检查了特定的药理学 NLRP3 炎症小体抑制是否有利于预防 LCWE 诱导的小鼠 KD 血管炎。 MCC950 是一种有效的特异性小分子，可直接与 NLRP3 NACHT 结构域的 Walker B motif相互作用，并在体外和体内鼠模型中抑制 NLRP3 活性和炎性体形成。囊性纤维化跨膜调节剂 (CFTR) 抑制剂 172（ CFTR(inh)-172) 是 CFTR 的合成抑制剂，它也以不依赖于 CFTR 的方式阻断 NLRP3 激活和 IL-1β/IL-18 释放。MCC950 和 CFTR(inh)-172 有效阻断了体外用 LPS 和尼日利亚菌素刺激的巨噬细胞产生的 IL-1β。 在体内，用 MCC950 或 CFTR(inh)-172 治疗导致 LCWE 注射的 WT 小鼠腹腔灌洗液中 IL-1β 和 IL-18 的release显着减少。
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- 注：A, IL-1β (interleukin-1β) measurements at 24 h post-LCWE injection in the peritoneal lavage of LCWE-injected WT mice pretreated with either PBS (n=19), MCC950 (n=24), or CFTR(inh)-172 (n=20). B, IL-18 measurements at 8 h post-LCWE injection in the peritoneal lavage of LCWE-injected WT mice pretreated with either PBS (n=8), MCC950 (n=6), or CFTR(inh)-172 (n=6). C and D, Representative H&E-stained heart sections
为了确定直接阻断 NLRP3 是否可以减少 LCWE 诱导的 KD 血管炎，WT 小鼠在 LCWE 注射前一天开始每隔一天接受 MCC950 或 CFTR(inh)-172。 与注射 PBS 和 MCC950 或 PBS 和 CFTR(Inh)-172 的对照小鼠相比，LCWE 注射导致与冠状动脉炎、主动脉炎和腔内肌成纤维细胞增殖相关的剧烈心脏血管炎症，模拟人类 KD 期间观察到的病理。
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- 注：(C) and heart vessel inflammation scores (D) of WT mice injected with LCWE (n=24), LCWE and MCC950 (n=15) or LCWE and CFTR(inh)-172 (n=10) at 2-wk post-LCWE injection. Scale bars, 500 μm. E and F, Pictures of the abdominal aorta area and H&E staining of abdominal aorta cross-sections。
相比之下，MCC950 或 CFTR(inh)-172 治疗显着减少了 LCWE 诱导的心脏血管炎症以及腹主动脉扩张和动脉瘤的发展。接下来测量了用或不用 MCC950 或 CFTR(inh)-172 处理的 PBS 和 LCWE 注射小鼠的血清中各种促炎细胞因子和趋化因子的产生。 注射后 2 周，LCWE 导致 IL-6 和趋化因子 CXCL1 水平升高； 已知介导中性粒细胞募集。 用 NLRP3 抑制剂 MCC950 或 CFTR(inh)-172 治疗可减少 LCWE 诱导的 IL-6 和 CXCL1 产生，同时促进抗炎细胞因子 IL-10 的产生。 有趣的是，在用 NLRP3 抑制剂治疗的 LCWE 注射小鼠中发现 MIP-1α 和 MIP2 增强，这可能反映了这些趋化因子促进巨噬细胞愈合反应。 总的来说，这些发现表明，用 MCC950 和 CFTR(inh)-172 抑制剂直接靶向 NLRP3 炎症小体激活足以在小鼠中预防 LCWE 诱导的心脏炎症和腹主动脉扩张和动脉瘤的发展。
Cellular Landscape in LCWE-Induced Abdominal Aorta Vasculitis
为了确定在鼠 KD 血管炎期间炎症和心血管病变发展中涉及的细胞组成和分子网络，接下来通过 scRNA-seq 检查了注射 PBS 和 LCWE 的对照小鼠的腹主动脉组织。 正如预期的那样，LCWE 注射导致腹主动脉扩张和动脉瘤的发展。为了获得稳态和 LCWE 诱导的 KD 血管炎期间腹主动脉细胞的图谱，从新鲜分离的腹主动脉组织中生成了 scRNA-seq libraries，这些组织从左肾动脉延伸到 PBS 和 LCWE 注射小鼠的主动脉分叉处。在生物信息学去除双细胞、死细胞和细胞碎片后，PBS 对照悬浮液中的 5386 个细胞和 LCWE 悬浮液中的 5091 个细胞被纳入后期质量控制分析。 来自 PBS 和 LCWE 条件的单细胞转录组被投影到统一流形近似和投影图（UMAP）中以进行可视化。通过使用基于图的方法结合规范相关性对齐和整合数据集来确定 PBS 和 LCWE 中共享和发散的细胞类型分析。 在这个cluster空间中，我们确定了 25 个我们用 SingleR 自动注释的细胞类型。（不知道这样的UMAP图，是不是被大家认为是批次效应去除了呢？）
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- 注：C, Experimental design of the scRNA-seq experiment. Single-cell suspensions were obtained from the abdominal aorta of PBS (n=9 tissues pooled) and LCWE-injected mice (n=6 tissues pooled) 2-wk post-injection. Following magnetic dead cell removal, cells were encapsulated and profiled using the Chromium 10× Genomics 3’ V3 kit. D, UMAP plot of all abdominal aorta cells isolated from PBS (n=5386 cells, blue) and LCWE-injected (n=5091cells, red) WT mice. E, UMAP plot as in (D) with cell type annotation.
对照小鼠的腹主动脉主要由基质细胞 (97.6%) 组成，包括 1 型 VSMC、成纤维细胞、血管内皮细胞 (BEC) 和淋巴管内皮细胞，而免疫细胞群很少。 相比之下，LCWE 注射小鼠的腹主动脉扩张和动脉瘤主要由先天性和适应性免疫细胞组成 (69.3%)
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Spatially Organized Communication Between Monocytes, DCs, Macrophages, and Stromal Cells Through the NLRP3/IL-1β/IL-18 Pathway
由于 IL-1β 在 KD 发病机制中具有关键作用，接下来试图破译参与 IL-1β 产生或 IL-1 信号传导的腹主动脉细胞网络。 与之前的报告一致，即 LCWE 注射小鼠腹主动脉中的 CD11c+ 巨噬细胞表现出 Caspase-1 (Casp1) 活性并且是 IL-1β 的来源,观察到 Nlrp3、Pycard、Casp1 和 Il1b 的共表达，这些关键成分 IL-1β 产生途径的影响，在浸润性巨噬细胞、炎性单核细胞（Cd14hi CD16/Fcgr3+ 单核细胞 1 型）和 DC 中。
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- 注：A, UMAP visualization (as in Figure 3D) split to show separated visualization of the scRNA-seq datasets from the abdominal aorta of PBS and LCWE-injected mice and representing a gradient expression of selected genes related to NLRP3 activation, IL-1β, and IL-18 production. Greyyellow-red gradient: min-max normalization of CP10K expression. B, Similar UMAP visualization in which cells in pink coexpress genes associated to the IL-1β production pathway (MyD88, Pycard, Casp1, and Il1b).
嗜酸性粒细胞和中性粒细胞也证实了这些标志物的共表达，表明它们也可能有助于 KD 血管炎期间腹主动脉中 IL-1β 的产生。 在 LCWE 注射小鼠的腹主动脉中观察到 Il18 转录物的类似表达模式，Nlrp3、Pycard、Casp1 和 Il18 的共表达主要在 1 型炎性单核细胞和浸润性巨噬细胞中观察到。在 NLRP3 激活和 IL-1β/IL-18 生产轴的另一端，包括 1 型 VSMC、2 型 VSMC、成纤维细胞和 BEC 在内的基质细胞共表达 Il1r1、Il1rap 和 Myd88，这是 IL-1β 信号传导所必需的 , 而免疫细胞群只有这些基因的分散和低共表达
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- 注：C, UMAP visualization split to show separated visualization of the scRNA-seq datasets from the abdominal aorta of PBS and LCWE-injected mice and representing a gradient expression of selected genes related to the IL-1 and IL-18 signaling pathways. Grey-yellow-red gradient: min-max normalization of CP10K expression. D, Similar UMAP visualization in which cells in pink coexpress genes associated to the IL-1 signaling pathway (Il1r1, Il1rap, and MyD88). CP10K indicates counts per 10 000 reads; and VSMC, vascular smooth muscle cell.
相反，IL-18 信号传导所需的 Il18r1、Il18rap 和 Myd88 基因的共表达主要在免疫细胞上观察到，例如浸润性 T 细胞、NK 和 NK T 细胞，而不是基质细胞。其他 NLRP3 和 IL-1β 相关基因的表达也在 LCWE 注射小鼠的腹主动脉中上调。 有趣的是，编码 IL-1 诱饵受体的 Il1r2 在抗原呈递细胞亚群中的表达很高.
接下来使用 ST 来表征空间组织和 NLRP3/IL-1β/IL-18 介导的细胞通讯在小鼠 KD 血管炎期间驱动 LCWE 诱导的心脏组织病变。来自注射 PBS 和 LCWE 的对照小鼠的心脏组织是注射后 2 周收集，并使用 10x Genomics Visium 平台分析组织切片
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经过质量控制分析，例如排除未覆盖组织的spot和相关H＆E切片上折叠等加工伪影，分别分析了LCWE和PBS注射小鼠心脏组织切片中的683和1803个spot，平均每个spot覆盖了3610个基因。 spot和数据集中共有 18408 个基因。 心脏组织切片的病理分析表明，与 PBS 注射相比，LCWE 注射导致细胞浸润和 CAA 血管重塑
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- 注：Heart tissue sections from PBS and LCWE-injected mice used for ST. Scale bars, 1 mm. H&E staining of the heart tissue sections (left) and H&E-stained tissue sections overlaid with the 3 clusters identified in an unsupervised manner in the transcriptomic data showing correlation with ventricle (cluster 0), atrium (cluster 1), and coronary/aorta (cluster 2) (right).
使用基于图形的方法结合CCA对齐和整合数据集，我们确定了 3 个不同的cluster对应于定义的解剖区域：心室、心房和冠状动脉/主动脉，如 H&E 部分和转录谱（心室中的 Myl2， Myl7 在中庭）。正如腹主动脉 scRNA-seq 分析所观察到的，LCWE 和 PBS 冠状动脉/主动脉簇具有显着的基因表达差异（n=1732 个基因，FC>2 和 FDR<0.05），包括基因 Ptprc/Cd45、Il1b、Lyz2、和 Ly6a/Sca-1。 LCWE 样本中上调基因的基因本体论分析确定了几个与炎症、免疫细胞迁移以及重要的是细胞对细胞因子（包括 IL-1 和 TNF）反应相关的基因集。对下调基因的类似分析确定了与正常心脏功能有关的途径，例如肌肉收缩和代谢。对 LCWE 和 PBS 冠状动脉/主动脉簇之间差异表达基因的 IPA 上游调节器分析确定 Tnf、Ifng、Tgfb1 和 Il1b 为the top regulators。
在scRNA-seq 分析中使用定义不同细胞类型的基因标记，我们绘制了它们在 PBS 和 LCWE 注射小鼠心脏组织中的空间定位。 来自注射 LCWE 的心脏组织围绕发炎冠状动脉的细胞浸润主要包含单核细胞、DC 和巨噬细胞，而中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞则散布在整个心肌中.
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这些细胞浸润在 PBS 对照小鼠的稳态下检测到最低限度，表明它们参与了 LCWE 诱导的 KD 血管炎期间心脏炎症和病变的发展。 注意的是，根据 scRNA-seq 分析，炎症浸润与 NLRP3、IL-1β 和 IL-18 通路相关转录本的高表达在空间上重叠。对 1 型和 2 型 VSMC 基因进行空间定位显示，与 PBS 对照相比，LCWE 诱导的炎症期间 1 型 VSMC 减少，而 2 型 VSMC 表达了更高水平的参与 IL-1 信号通路的基因，例如 IL- 1 受体 (Il1r1)、Il1rap 和 Myd88，在注射 LCWE 后冠状动脉周围更丰富。 成纤维细胞围绕 2 型 VSMC 的血管周围核心，并在空间上与 IL-1 信号相关的转录本重叠，尽管水平低于富含 2 型 VSMC 的区域。 IL-18 信号通路相关基因（Il18r1、Il1rap 和 Myd88）的共表达强度低于 IL-1 信号通路。
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总体而言，LCWE 诱导的 KD 血管炎与心血管病变中先天性和适应性免疫细胞的强烈浸润有关，这些细胞高度表达与 IL-1β 产生相关的基因。 在 LCWE 注射小鼠的心脏组织中，浸润的单核细胞、巨噬细胞和包围发炎冠状动脉病变的 DC 的核心是 IL-1β 产生的主要来源，并被 2 型 VSMC 和成纤维细胞包围，它们表达高水平的基因 属于 IL-1 信号通路。 在注射 LCWE 的小鼠的发炎腹主动脉组织中也观察到与 IL-1β 产生或信号传导相关的类似基因表达的细胞模式。
IL-1 Signaling in VSMCs Mediates LCWEInduced KD Vasculitis
通过腹主动脉和心脏组织病变 ST 的 scRNA-seq，发现在 LCWE 诱导的 KD 血管炎期间，由于 Il1r1、Il1rap 和 Myd88 共表达，包括 VSMC 和成纤维细胞在内的基质细胞对 IL-1 的反应能力最大 . 此外，ST 证明 IL1 反应细胞集中在发炎冠状动脉周围的区域，与成纤维细胞和 VSMC 共定位，表明 IL-1β 可能作用于这些细胞以介导发病机制。 因此，试图更好地了解这些细胞类型中的基因表达和表型变化。
差异基因表达分析 (FDR<0.05, FC>2) 表明，LCWE 注射小鼠腹主动脉中的成纤维细胞显示与蛋白质翻译相关的转录本（包括 45 个核糖体蛋白基因、9 个真核翻译起始因子）的表达大量增加 基因和 2 个线粒体核糖体蛋白基因），以及参与细胞粘附和免疫反应的基因。 IPA 上游调节器分析确定了调节细胞代谢的 Mlxipl 作为这些基因以及炎性细胞因子（包括 Tnf、Ifng 和 Il1b）的顶级调节器。 LCWE 上调基因的基因本体分析确定了涉及翻译、细胞粘附、免疫和炎症反应、血管生成、胶原纤维组织和骨化的途径，而对 LCWE 下调的基因的类似分析确定了涉及细胞外基质组织、细胞粘附、 骨化和胶原信号传导.
差异基因表达分析 (FDR<0.05,FC>2) 表明，LCWE 注射小鼠腹主动脉中的 VSMC 显示出与成纤维细胞（Lum、Dcn、Thbs1 和 Fbln2）相关的转录本表达大幅增加和下调 参与收缩功能的转录本，包括 Myh11、Myl9、Lmod2、Tpm2、Myocd 和 Acta2。此外，来自 LCWE 注射小鼠的 VSMC 显示出 MMP（Mmp2 和 Mmp14）、MMP 抑制剂 Timp1、趋化因子和参与免疫细胞募集的基因（Cxcl1、Cxcl12、Cxcl2、Ccl2 和 Vcam1）的表达增强。 IPA 上游调节因子分析确定 Il1b 是这些基因的顶级调节因子，其他重要的上游调节因子是 Myd88 和其他炎性细胞因子，包括 Tnf、Ifng、Il22 和 Il18。LCWE 注射后 VSMC 中上调基因的基因本体分析确定了涉及炎症、趋化性、细胞迁移和伤口愈合的通路，而对 LCWE 下调的基因进行的类似分析确定了涉及细胞粘附、细胞外基质组织、肌肉和心脏发育的通路， 肌肉收缩、弹性纤维组装、细胞迁移和细胞生长。 总体而言，这些数据表明 LCWE 诱导腹主动脉中 VSMC 的显着表型转换。
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- 注：A, Gene expression profile (Volcano plot) of abdominal aorta VSMCs from LCWE-injected mice vs VSMCs from control PBS-injected mice (red represents FDR <0.05 and FC >2). B, IPA analysis of upstream regulators (top 10 up-(red) and top 5 down (blue)) in abdominal aorta VSMCs of LCWE-injected mice when compared with PBS control mice. C, Biological process of upregulated and downregulated genes (FC>2, FDR<0.05) in VSMCs from the abdominal aorta of LCWE-injected mice when compared to control PBS mice. The size of the dot represents how many genes were found in the biological pathway and the color indicates up or downregulation of those genes.
Overall, these data demonstrate LCWE induces a profound phenotype switch of VSMCs in the abdominal aorta.
ST 数据显示 2 型 VSMC 位于冠状动脉的血管周围区域，靠近产生 IL-1β 的细胞。 此外，VSMC 基因表达变化的最高调节因子是 IL-1β，这使我们假设 VSMC 可能是介导 IL-1β 致病反应的主要细胞类型。 我们接下来通过使用具有他莫昔芬诱导的平滑肌细胞 (SMC) 特异性 Il1r1 敲除的小鼠（Myh11Cre-ERT2 小鼠与 Il1r1fl/fl 小鼠杂交）研究了 VSMC 中的 IL-1 信号传导如何促进 LCWE 诱导的 KD 血管炎的发展。 Myh11Cre-ERT2 Il1r1Δ/Δ 和 Il1r1fl/fl 同窝对照小鼠喂食他莫昔芬 2 周以诱导 Il1r1 缺失，然后在 LCWE 注射前在normal chow上休息 4 周.In a separate experiment, Il1r1fl/fl littermate controls and Myh11Cre-ERT2 Il1r1Δ/Δ mice were injected IP with tamoxifen for 5 consecutive days, then rested for 4 weeks before LCWE injection. In both experimental models, the specific deletion of Il1r1 in SMCs during LCWE-induced KD vasculitis resulted in significantly reduced heart vessel inflammation and abdominal aorta dilatation and aneurysm formation.这一发现表明 VSMC 中的 IL-1R 信号传导对 LCWE 诱导的 KD 血管炎具有深远的影响，并且 VSMC 可能是 IL-1 诱导的腹主动脉瘤和 CAA 形成的主要介质。
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- 注：C, UMAP visualization (as in Figure 3D) split to show separated visualization of the scRNA-seq datasets from the abdominal aorta of PBS and LCWE-injected mice and representing a gradient expression of Acta2, Lum, and Mki67. Grey-yellow-red gradient: min-max normalization of CP10K expression. D, Annotated H&E heart sections from PBS and LCWE-injected mice (as in Figure 6C) and overlaid expression of Acta2, Lum, and Mki67. Dark blue spots; no coexpression of Acta2, Lum, and Mki67. Light blue-red gradient: min-max normalization of CP10K expression. Scale bars, 500μm
DISCUSSION
在这里，使用 scRNA-seq 和 ST 分析在 KD 血管炎小鼠模型中创建了浸润心血管病变的免疫细胞的转录组图谱。 我们的研究表明，多种先天性和适应性免疫细胞迁移到发炎的血管组织，并且与 NLRP3 炎症小体激活、IL-1β 产生和信号传导相关的转录物在心血管病变中大量表达。 我们发现特定的免疫细胞亚群，如巨噬细胞、单核细胞和 DCs，是 IL-1β 的主要来源，而基质细胞，如成纤维细胞和 VSMCs，对 IL-1β 有反应，这导致表型重编程和 心血管病变。 IL-1 在 KD 血管炎期间的致病作用得到了人类转录组数据集的进一步支持，该数据集显示在急性 KD 期间 IL1 和 NLRP3 相关基因的丰度增加。 用特定的小分子抑制剂阻断 NLRP3 激活，或阻止 VSMC 上的 IL-1β 信号传导，减少了小鼠 KD 心血管病变的发展。 通过鉴定参与 KD 炎症反应的关键细胞亚群并强调 NLRP3 炎症小体和 IL-1β 信号在 KD 血管炎期间的重要性，我们的结果提高了目前对 KD 发病机制的理解，并表明靶向 NLRP3/IL-1β 通路可能 抑制 KD 儿童心血管病变的发展。
从 KD 患者身上收集的死后组织的组织学分析表明，在疾病的急性期，CAA 中存在 CD8+ T 细胞、IgA+ 浆细胞以及中性粒细胞和巨噬细胞；然而，它们对 KD 发病机制和炎症反应的具体贡献仍不清楚。我们对 LCWE 诱导的 KD 小鼠模型中腹主动脉瘤和扩张以及心脏组织的 scRNA-seq 和 ST 分析也揭示了免疫细胞的深刻浸润，例如活化的 T 细胞、DC、单核细胞和巨噬细胞。心外膜冠状动脉炎和进行性管腔肌成纤维细胞增殖等组织学特征是人类 KD 的病理标志，在 LCWE 诱导的 KD 血管炎中也观察到这些特征，并且可以通过用于治疗人类 KD 的疗法来预防，例如 IVIG 和 IL-1β 抑制剂或IL-1R 拮抗剂（阿那白滞素）。此外，与人类 KD 类似，注射 LCWE 的小鼠会出现心肌炎和长期并发症，例如心肌重构和纤维化。急性 KD 期间循环 IL-1β 和 IL-18 的水平增加。 然而，缺乏参与 IL-1β 产生和响应 IL-1β 的细胞亚群的身份，这对于理解潜在的病理机制至关重要驱动 KD 血管炎。
研究表明，在 LCWE 诱导的心血管病变中，浸润性巨噬细胞、单核细胞和 DC 表达高水平的 Nlrp3、Il1b、Pycard、Casp1 和 Il18 转录本，这表明这些细胞可能是 IL-1β 和 IL 的主要来源 -18 在发炎的腹主动脉瘤和心脏冠状动脉病变中。 这些结果与先前发表的研究结果一致，即来自 LCWE 注射小鼠心血管病变的巨噬细胞显示出 caspase-1 活性。 有趣的是，与 Nlrp3 相比，这些细胞中 Nlrc4 和 Nlrp12 的表达相对较低，表明 NLRP3 炎性体是 LCWE 诱导的 KD 血管炎期间 IL-1β 的主要激活剂。 然而，IL-1R 转录物 (Il1r1) 在浸润病变的免疫细胞中的表达很少，表明它们的致病功能可能独立于直接的 IL-1R 信号传导。
在 LCWE 诱导的 KD 血管炎期间，心血管病变的基质细胞群的巨大变化是明显的。 ScRNA-seq 和 ST 分析揭示了在 LCWE 诱导的 KD 血管炎期间 VSMCs、成纤维细胞和 BECs 群体的全局转录组的巨大变化，表明可能的表型和功能变化。 在之前的一份报告中，我们在 WT 和 Il1r1-/- 小鼠之间产生了骨髓嵌合小鼠，并表明在 LCWE 诱导的 KD 血管炎中，非内皮基质细胞需要 IL-1 信号传导，而不是骨髓衍生的造血细胞。 与这些发现一致，心脏组织切片的腹主动脉和 ST 的 scRNA-seq 分析表明，IL-1 信号传导所需的 Il1r1、Il1rap 和 Myd88 的共表达仅限于心血管病变中的基质细胞 ，包括 VSMC、成纤维细胞和 BEC.
观察到，在注射 LCWE 的小鼠的腹主动脉和 CAA 中，VSMCs 表型从 1 型转变为 2 型 VSMCs。表型转换的 VSMC 2 型共表达 αSMA 和 Lumican 位于冠状动脉周围的血管周围区域，靠近产生 IL-1β 的细胞。在健康组织中，VSMC 具有收缩表型，可提供机械强度和血管张力。在动脉粥样硬化和腹主动脉瘤等疾病中，VSMC 会发生表型转换。 “合成”VSMC 的特征是收缩蛋白表达减少、MMP 表达增加、增殖和迁移增强以及细胞凋亡增加。在动脉粥样硬化中，“血管平滑肌细胞到成纤维细胞的转变”也已被确定，平滑肌细胞 (SMCs) 分化为纤维肌细胞，这一过程甚至可能对动脉粥样硬化有益。 事实上，虽然 IL-1β 在促进动脉粥样硬化病变方面起着致病作用并且靶向 IL-1β 导致心血管事件的复发率显着降低，一些研究还表明，IL-1β 信号还可以通过促进 VSMCs 转换来保护晚期动脉粥样硬化，导致纤维帽重塑，增加斑块稳定性动脉粥样硬化，在这里，我们表明 VSMC 中 Il1r1 的特定缺失减弱了 LCWE 诱导的 KD 血管炎期间向 2 型 VSMC 的表型转换，表明 IL-1β 直接介导了这一过程。在 LCWE 注射小鼠的腹主动脉中观察到的 VSMC 具有纤维肌细胞和合成 VSMC 的特性，显示收缩蛋白的表达减少，成纤维细胞标记物、MMP、炎症和增殖标记物的表达增加。在 KD 血管炎中，VSMC 向肌成纤维细胞的转变显然是有害的，因为它通过管腔肌成纤维细胞增殖导致冠状动脉狭窄，这是 KD 血管炎病理学的标志。 VSMCs 1 型向 VSMCs 2 型的这种表型转变，更增殖和表达 VSMC 和“成纤维细胞样”特征，可能参与 LCWE 注射小鼠冠状动脉的闭塞性重塑。与我们的研究一致，已发现 IL-1β 可直接调节平滑肌细胞表型，包括平滑肌细胞标志物（Acta2 和 Myh11）的下调和促炎基因的诱导，以及 MMP3 介导的增殖的诱导.
尽管 IVIG 治疗降低了发生 CAA 的风险，但高达 20% 的 KD 患者对 IVIG 具有抗药性，并且发生 CAA 的风险更大。因此，研究替代的有效和更有针对性的疗法以预防 CAA 的发展是一个主要的研究重点。
对来自 KD 患者的公开可用测序数据集的转录组分析，以及与急性 KD 期间 IL-1β 和 IL-18 循环水平升高的报告以及使用 KD 血管炎实验模型收集的证据相关的已发表研究，都集中在一个关键的NLRP3/Caspase-1/IL-1 通路在这种疾病中的致病作用。虽然阿那白滞素目前正在用于治疗 IVIG 耐药患者的各种临床试验中进行测试，但 NLRP3 抑制剂可能提供一个有吸引力的替代方案，因为它们可以抑制额外的NLRP3 介导的炎症通路，同时降低感染风险，可以口服给药。我们研究的一个关键方面是证明用 2 个独立抑制剂直接靶向 NLRP3 炎症小体成功地预防了 LCWE 注射小鼠的 CAA 和腹主动脉瘤和扩张。 MCC950 是一种高度特异性和有效的 NLRP3 小分子抑制剂，可在体外和体内阻止 NLRP3 寡聚化、炎症小体功能以及 IL-1β 和 IL-18 的产生.
CFTR(inh)-172 是一种合成的 CFTR 抑制剂，据报道也能以不依赖 CFTR 的方式阻断 NLRP3 激活和 IL-1β/IL-18 释放。两种 NLRP3 抑制剂在降低 LCWE 诱导的心血管疾病的严重程度方面都非常有效 这种 KD 血管炎小鼠模型中的病变。 研究表明，MCC950 治疗减少了 Apoe-/-（载脂蛋白-e 缺陷小鼠）的动脉粥样硬化病变的发展，减少了心肌梗塞小鼠模型中的心脏纤维化并改善了心脏重构，并防止了主动脉瘤小鼠模型中的主动脉破坏和动脉瘤形成。 动脉瘤，突出其对心血管疾病的治疗潜力。 连同我们的数据显示 MCC950 和 CFTR(inh)-172 通过抑制 IL-1β 抑制 LCWE 诱导的 KD 血管炎，有令人信服的证据表明使用 NLRP3 抑制剂来抑制 KD 和其他炎症性血管疾病。
与 IL-1β 阻断相比，NLRP3 抑制可能通过抑制 IL-18 成熟和细胞焦亡细胞死亡，从而更大程度地抑制 IL-1β 依赖性和非依赖性炎症。与发热对照组相比，急性 KD 患者血清中的 IL-18 水平显着升高。13 在 LCWE 诱导的 KD 小鼠模型中，我们观察到 IL-18 在驱动心脏血管炎症中起重要作用。因此，IL-1β 和 IL-18 可能协同作用以驱动 KD 病变的发展。我们的 scRNA-seq 和 ST 数据表明 IL-1β 和 IL-18 转录物由血管病变中的单核细胞和巨噬细胞表达。然而，与基质细胞上的 IL-1β 信号传导相反，IL-18 可能主要通过 T 细胞、NK T 细胞和 NK 细胞上的信号传导发挥作用。 IL-18 与许多自身炎症和心血管疾病有关，包括动脉粥样硬化。事实上，IL-18 在存在于 Apoe-/- 小鼠动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞中高度表达，并且 IL-18 促进巨噬细胞 IFN-γ 表达。56,57 IL-18 还增加了 IL-12 诱导的 IFN-γ 表达CD4+ 和 CD8+ T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞。 5虽然需要进一步研究来研究 IL-18 功能的确切机制，以及 IL-18 和 IL-1β 如何协同作用，但研究结果表明，阻断 NLRP3 将抑制 IL-1β 和 IL-18 驱动的心脏血管炎症，因此可能比仅针对 IL-1β 途径的治疗策略更有效。
总之，文章确定了心血管病变中 VSMC 向增殖性和炎症性成纤维细胞样细胞类型的表型转换，并且 IL-1β 信号传导是 KD 血管炎小鼠模型中致病性 VSMC 反应的核心。 血管组织浸润巨噬细胞、单核细胞和 DC 表达最高水平的 NLRP3 和 IL-1β 转录本，我们提供了来自人类和鼠类数据的确凿证据，表明 NLRP3 是治疗 KD 血管炎的强大治疗靶点。
Method
单细胞部分
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空间转录组部分
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