【文献分享】细菌效应子模拟作为HSP90的客户蛋白来破坏免疫

写在前面
    本次分享一篇于2020年发表在Cell上的paper，“A Bacterial Effector Mimics a Host HSP90 Client to Undermine Immunity”，第一单位是美国德州西南医学中心。主要讲述了细菌的Type 3效应子HopBF1，具有激酶活性，能够磷酸化宿主的HSP90(分子伴侣蛋白，促进蛋白质折叠，包括免疫受体和免疫激酶；辅助NLR的激活；且在多个物种中广泛存在)，使其失活，最终阻止了免疫受体的激活，从而达到促进侵染的目的。

Reslts

1. HopBF1 Adopts a Minimal and Atypical Protein Kinase Fold

    作者首先通过生物信息学的方式 (通过蛋白质结构和催化活性断定为激酶，而不是根据一级序列来判断为激酶) 以及人工注鉴定到一个细菌中的T3SS效应子-HopF1。HopF1在许多革兰氏阴性菌中都有，包括动植物的一些致病菌或共生菌。
    比较HopBF1的161个homolog发现，它具有保守的蛋白激酶残基，包括结合ATP的高度保守的Gly残基、经典激酶PkA的活性位点Asp(F1A)。爱文氏菌(人体致病菌)的HopBF1与PKA的RMSD(一个结构相似性参数)为3.2埃(F1CD)，通过对各部分结构进行比对和解读后发现，HopBF1具有最小的非典型激酶结构域。

F1 HopBF1 adopts a minimal protein kinase fold.png

2. HopBF1 Induces Severe Disease Symptoms in Plants

    由于HopBF1的大多数homolog都出现在丁香假单胞菌中，因此主要采用丁香假单胞菌来研究其功能。烟草中表达HopBF1及其活性突变形式(D154A,D169A)，在WT中表现出强烈的病斑坏死，而突变体缺没有(F2AB)。为了查明HopBF1在侵染过程中是否会造成组织坏死(文章里这个地方是用的cell death来表示，我个人觉得不妥，因为植物里的cell death通常是和HR联系在一起，这里明显是想看病斑的大小，可能跟作者主要做医学有关)，在无效应子的丁香假单胞菌中分别表达这三种形式，然后侵染拟南芥和烟草，发现同样的病斑坏死现象(F2CD)。体外和体内试验共同说明HopBF1的激酶活性对它在拟南芥、烟草中造成病害是重要的。

F2 HopBF1 induces severe disease symptoms in plants.png

3. HopBF1 Phosphorylates Eukaryotic HSP90

    之前报道细菌的效应子通常靶向真核生物保守的信号成分，而酿酒酵母通常用作效应子靶向底物的鉴定。将HopBF1及其突变形式转入酿酒酵母中发现，转入正常形式造成生长缺陷(F3A)。为了鉴定HopBF1潜在的底物，将HopBF1及其突变形式与酵母提取物混合孵育，同位素示踪试验发现，正常形式的HopBF1在80kDa附近有明显的条带(F3B)。酵母中转入flag-HopBF1，IP-MS鉴定到80kDa附近的带是HSP82/HSC82(F3C)，是人的HSP90在酵母里面的homolog。Co-IP验证了其可以互作(F3D)。
    体外磷酸化试验证明，HopBF1能磷酸化HSP82(F3E)，来自多种菌的HopBF1也能磷酸化HSP82(当然也有不能磷酸化的)，同样，丁香假单胞菌的HopBF1也能磷酸化小麦的HSP90和人的HSP90β(F3F)，但不能磷酸化E.coli和丁香假单胞菌的HSP90(F3G)。HopBF1的激酶活性似乎是特异的，因为它不能磷酸化通用磷酸化底物myBP和casein(F3H)。因此，HopBF1似乎是一个针对真核HSP90的激酶。

F3 HopBF1 Phosphorylates Eukaryotic HSP90.png

4. HopBF1-Dependent Phosphorylation of HSP90 Inactivates ATPase Activity and Chaperone Function

    MS鉴定到HSP90的磷酸化位点是Ser99和Thr101(F4A).Ser99突变后，HSP90不能被磷酸化；Thr101突变后，磷酸化不受影响(F4B)。Ser99在HSP90家族是保守的，控制了HSP90和ATP的结合(F4 CD)。HopBF1与HSP90共孵育后或组成型激活形式的HSP90（S99E）减少了分子伴侣的ATP酶的功能，与HSP90抑制剂- geldanamycin发挥的作用一致(F4E)。
接下来作者想看HSP90分子伴侣的功能是否受磷酸化影响，在哺乳细胞中共转HopBF1和两个HSP90客户(v-src(肿瘤酪氨酸激酶);内源免疫受体NLRP3)，发现v-src酪氨酸磷酸化水平和蛋白水平、NLRP3的蛋白水平都减少了(F4FG)。这也就说明，HopBF1磷酸化HSP90，磷酸化后的HSP90丧失了ATPase和分子伴侣功能。

5. HopBF1 Phosphorylates and Inactivates HSP90 in Yeast

    作者为了探究HopBF1的催化功能，创造了多种突变体，其中离子对残基E74A突变后，HopBF1在酵母中的生长缺陷作用减弱(F4I)。在转入HopBF1的酵母中过表达HSP90不能恢复其生长缺陷，可能是因为HopBF1在催化方面起作用(F4H)。这些结果就说明HopBF1在酵母中引发的生长缺陷是磷酸化HSP90，让其失活的结果。

F4-1.png

F4-2.png

6. HopBF1 Phosphorylates HSP90 during Infection

    使用表达HopBF1及其活性突变形式的丁香假单胞菌侵染 过表达HSP90的烟草叶片，结果发现叶片在3天时出现病斑，6天扩大(F5A)。而表达 HSP90 S100F(磷酸化位点突变)或YFP 被丁香假单胞菌侵染，有显著减小的病斑(F5A)。过表达HSP90，而不是S100F加快了病斑的形成，这就说明提升HSP90的Ser100 水平也许对植物是有毒的。总之，这说明HSP90Ser100 在侵染过程中被HopBF1磷酸化。
    植物中，NLR的激活，如RPM1，需要HSP90。 因此作者推断HopBF1失活HSP，阻止了RPM1的激活。瞬时表达RPM1 D505V(自激活形式)引发了HR(F5B)，共表达RPM1 D505V和HopBF1减少了HR。这就说明HopBF1通过磷酸化失活HSP90干扰了RPM1 D505V的激活，从而阻止了HR。

F5 HopBF1 targets plant HSP90 during P.syringae infection.png

7. HopBF1 Mimics an HSP90 Client

    因为HopBF1和HSP90互作，所以想看看HopBF1是否能作为HSP90的“客户蛋白”。
在293细胞中表达HopBF1 D170A(失活形式),并用HSP90的抑制剂处理，发现293细胞系中抑制HSP90后，HopBF1 D170A的和v-src的蛋白水平都减少(F4A)。

    真核生物中，HSP90一般共分子伴侣蛋白CDC91一同发挥作用，促进客户激酶的成熟。Co-IP发现，HSP90和CDC37与v-src互作，但是在HopBF1的IP产物中并没有检测到CDC37(F6B)。沉默CDC37后，影响了HSP90和v-src互作，但不影响HopBF1和HSP90的互作(F6C)。这就说明HopBF1与HSP90互作时并不需要CDC37.

    客户蛋白激酶的αC-β4 loop在被HSP90识别时发挥重要作用，突变这个区域后(V89D )，发现HopBF1对酵母生长缺陷的表型极大减少了。在细菌中表达HopBF1 V89D，能检测到蛋白；而在哺乳细胞中表达HopBF1 V89D 时，WB并没有检测到，因为不适当地靶向HSP90会被蛋白酶体途径降解(F6E)，施加MG132后又能检测到蛋白，说明HopBF1 V89D确实被蛋白酶体途径降解了。
    为了查明HopBF1 V89D在植物中的作用，在丁香假单胞菌中转入HopBF1正常形式和突变形式，然后侵染烟草，发现表达正常的HopBF1造成极大的组织坏死，而HSP90的互作突变体HopBF1 V88D或 活性突变体D169A并没有造成组织坏死，总的来说，HopBF1模拟作为HSP90的客户。

F6 HopBF1 mimics an HSP90 client.png

后记
1.对于HopF1的发现，使用的生物信息学工具还是蛮有意思的，后面如果有时间可以尝试复现一下。

2. 文章写作方面，阴性结果和阳性结果都要有，这样才真实。

3.酵母是个好兄弟，可以拿来做真核保守性的开胃菜；还能用其筛选保守的互作蛋白。