原核表达常见问题（三）蛋白纯化后续的问题分析

蛋白纯化后续的问题分析

1.目的蛋白纯化浓缩之后，目的蛋白条带周围出现杂带，据推测可能是插入目的基因后，外源基因的表达刺激大肠杆菌产生了宿主蛋白酶，对异源蛋白进行降解的产物。

缓冲液如何选择

用 Tris-HCl 还是 PB，选择的依据是蛋白质的稳定性和活力在哪个缓冲液中好，浓度一般 50mM，但是缓冲液应与

样品缓冲液有相同的 pH 和离子强度。

洗脱采用的离子强度的大小范围应该如何确定

离子交换纯化是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样达到分离目的的一种蛋白纯化分离技术,离子强度越大，洗脱越好。具体的离子浓度范围可以很大，0.01mol/l 到 1mol/l，甚至 3.0mol/l，PH值的范围液很广。主要根据你的蛋白质的等电点。

蛋白挂在阳离子交换柱上洗脱不下来

1. 蛋白与离子柱得结合太强，换弱阳的琼脂糖凝胶介质，比如由 sp 的换成 CM

2. 减少离子柱与样品的结合时间，防止蛋白沉在柱上。

3. 若洗不下来的是杂蛋白直接用 0.1M 氢氧化钠洗。

标签蛋白易洗脱

1. 离子交换每个梯度都洗下来目标蛋白，最大可能性是上样量过大，流速太大，建议增加清洗的体积数，减

少上样量，降低上样速度。

2. 上样完洗脱前，清洗的不彻底。

3. 标签没有表达出来：1. 可能是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上无法与离子柱结合。2. 标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上。

4. 填料有问题，换填料。

5. PH、离子强度是否合适，平衡缓冲液是否应与样品缓冲液 pH、离子强度相同。

标签包涵体蛋白易洗脱

1. 蛋白质的折叠形态发生了改变隐藏了标签，而使得蛋白质无法挂柱。

1. 因临近的空间的一个或多个氨基酸的空间位阻阻碍了标签与离子柱形成共价键。

2. 环境影响：pH，离子强度，其他蛋白质分子，缓冲溶液类型，有关影响蛋白质分子表面的试剂等。增加所提的蛋白质样品的溶解度或还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型。

2. 柱子没平衡好，平衡缓冲液没加咪唑，平衡液 PH 不适合，缓冲液 pH 要与蛋白质 pI +/-1-2。

3. 有比邻的组氨酸的污染蛋白质与离子柱结合，通过降低洗脱液 pH 值使得标签质子化而使得污染蛋白质从

层析住上被洗脱。

4. 一些蛋白质或 DNA 与带有标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用， 可以用低浓度的去污剂 （2%的 Triton

X-100 或浓度不大于 0.5%SDS)洗涤样品 （上样洗脱时） 或增加洗脱液的盐浓度 （氯化钠溶液低于 2mol/L） 。

5. 填料有问题，换填料。

6. 最后可以考虑一下试剂的问题。

目的蛋白先洗脱杂蛋白被吸附

1. 更换缓冲液，可能 pH 与蛋白质 pI 较接近。

2. 填料选择不对，与蛋白结合力太弱，更换适合改纯化蛋白质的填料。

3. 直接收取目的蛋白，再用其他纯化方法进一步纯化。

蛋白纯化出现沉淀

1. pH 发生变化，导致蛋白质沉淀。找准蛋白质的一个等电点，溶液环境的ph值不能在蛋白质等电点的附近，如果在等电点的附近的时候，这个时候蛋白非常容易沉淀。可根据软件计算入VECTOR NTI计算其理论等电点，尽量纯化的溶剂在远离等电点。

2. 离子溶度过高，缓冲液的离子溶度降低。人为配制的溶液环境，不一定真正符合蛋白本身的“生存”的环境要求，所以要从离子浓度和pH去考虑，特别是盐离子浓度；所谓的盐浓度，就是盐析效应。高浓度的盐破坏蛋白的水化层，使得蛋白质聚集沉淀。常用的就是硫酸铵沉淀。盐析沉淀通常对蛋白质的高级结构没有破坏，再溶时活性可以完全恢复。常见的例子就是硫酸铵沉淀纯化IgG。同样，硫酸铵沉淀也常碰到不可逆的情况。例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组蛋白往往在硫酸铵沉淀后再溶困难。

3.在Ni纯化的过程中，有一部分镍离子会脱落，脱落的镍离子属于重金属，会对蛋白的凝集和沉积起到一定的作用。

4.蛋白反复冻溶，过程中生成的一些小冰晶会对这个蛋白的结构造成一定的伤害，离子和缓冲液状态发生较大变化；

5.如果长时间放在4度的情况之下蛋白质，容易滋生微生物，微生物的生长的可能造成蛋白的性质变化或者降解也容易产生一些聚集沉淀；

如何避免和解决重组蛋白纯化后聚集沉淀呢？

1.我们建议如果用镍柱来纯化蛋白的时候，纯化的过程纯化之后的溶液当中适当的加一点EDTA，让它螯合脱落下来的镍离子，减少重金属对蛋白的伤害；

2.我们可以加点分散剂，避免蛋白质分子接触碰撞，减少它的聚集，这些分散剂，比如说甘油，聚乙二醇，甘露醇，还有这个山梨醇之类的

3.我这个蛋白的话允许你加入一些辅助性的保护蛋白的话，那是最好比如说这个白蛋白，

4.可以加一点个氨基酸，比如说精氨酸

5.准确的算出蛋白质的pI等电点，算等电点是要把整个蛋白包括融合的部分都代入计算，包括载体上的人和蛋白，所以这样才能算出一个准确的等电点，溶液的环境的pH值，要避免在等电点附近.

6.一个蛋白有些蛋白比较娇贵，有些蛋白比较皮实，在这过程中的话，我们还要避免蛋白的一些热损伤

7.很多的蛋白的话，它独立的时候是很难存在的，它必须有一些辅助的离子或者辅助的一些蛋白，它才能够一个很好的维持一个很好的一个构象，所以必要的时候添加它的一些辅助的蛋白或者是因子

8.每个蛋白的情况都不一样，也许你在处理其他蛋白的时候都很好，但是处理这个蛋白的时候情况完全不一样，这就是为什么呢？我们研究的这些蛋白，有时候没有一招鲜或者是通用方案；我们曾遇过这样的一个案例，某个寄生虫体内的一个酶，我们表达的时候，它可以得到上清表达非常好，我们对其中的一个氨基酸进行突变，它立马从上清表达状态变到包涵体表达状态；从这个地方我们是否可以通过加减氨基酸为蛋白质”改命“（改性）。

9.若发生不可逆沉淀，可以选择离心，过滤等方式去除。

注意事项

1. 倒入速度不要太快，以防产生泡沫和气泡。

2. 装柱的注意事项:

1. 装柱时应注意液面不能低于树脂表面。

2. 树脂悬浮液的温度要相对恒定或与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响分离效果。

3. 装好的柱体应该没有“纹路”、节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。否则需要重新装柱。

4. 在装柱的同时应该将其他仪器设备（如：恒流泵等）电源接通，并按实验要求进行预热和调试。需

将恒流泵流速调至 0.4ml/min。

3. 应将洗脱液放至液面与树脂相切时再上样，且样品一旦加入就应该立即开始收集流出液。 （第一管，应在

4ml 处做一标记）。 

4. 加样时要沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面，以及在柱内形成气泡，影响分离效果。