摘要：
新冠患者SARS-CoV-2 entry受体ACE2的表达比正常高了3倍，并与免疫细胞的干扰素表达相关。
和中度患者相比，重症患者显示出更强的上皮细胞免疫细胞互作，引起免疫细胞激活，炎性巨噬细胞表达CCL2, CCL3, CCL20, CXCL1, CXCL3, CXCL10, IL8, IL1B 和 TNF。
和中度患者相比，重症患者的转录差异可能引起了免疫介导的组织损伤、肺损伤和呼吸衰竭。
药物抑制CCR1和/或CCR5通路可能可以抑制重症COVID-19患者的免疫活化。
为了从分子和细胞水平探究COVID-19的机制，该研究通过单细胞测序对患者和正常对照的鼻咽和支气管样本进行了检测。此前有研究使用单细胞测序检测了COVID-19患者肺泡灌洗液样本，较全面的揭示了下呼吸道的免疫表型。然而SARS-CoV2和其它冠状病毒在上下呼吸道都可以感染和复制。上呼吸道的主要作用在于清除吸入的病原体从而阻止病毒侵入下呼吸道引起肺部损伤。控制病毒扩散依赖于上皮细胞和免疫细胞之间的相互作用。在病毒清除后，激活的免疫细胞必须被清除以避免免疫系统的过度激活并加重组织损伤。有证据显示重症COVID-19患者的组织损伤是由过度激活的免疫反应而非病毒持续扩散所介导。为了探究这些问题，作者对COVID-19患者的上下呼吸道包括上皮细胞和免疫细胞的样本进行了检测，以期更全面的研究疾病发生时的黏膜免疫。
该研究发现疾病严重程度和呼吸道上皮和免疫细胞的相互作用相关，高度活化的促炎性巨噬细胞和细胞毒性T细胞似乎促进了上皮细胞死亡。
1. Cellular and molecular characterization of COVID-19 severity
样本包括8个中度症状新冠患者(取了14个鼻拭子(图1b中的方块)，11个重症患者[(取了11个鼻拭子(图1b中的方块，2个支气管灌洗液(图1b中星号)]，5个正常对照(只取了鼻拭子)。采集的36（？文中写的36，我只看到了32个）个样本进行了3′ scRNA-seq。
一共得到了160528个细胞。鼻拭子样本的细胞鉴定得到了22个细胞群。细胞群和比例变化如下图。
数据处理：
- 前期处理：测得的raw data首先使用了
CellRanger处理，再使用SoupX⚠️过滤了背景RNA（MUC1, MUC5AC and MUC5B作为marker基因）。过滤后的矩阵被载入Seurat。- 过滤标准：< 200 gene & >percent.mt >15%，样本间UMI过滤上限标准不统一（从50000-200000不等）。（注：同一来源的样本，标准应尽量统一）
- 标准化：The samples were normalized to 10,000 reads, scaled and centered.(Seurat标准操作)
- 样本整合：使用的是Seurat的
SelectIntegrationFeatures()锚点整合功能。
这种整合方法此前介绍过，见：多个10x单细胞对象的合并和批次校正--seurat锚点整合+Harmony。我个人更喜欢Harmony。- 降维：PCA和UMAP都是Seurat常规操作。
- 分群：FindNeighbors()和FindClusters()也是Seurat常规操作。
值得注意的是，在PCA后，FindNeighbors()分析选了90个PC。一般不会用到这么多，是因为细胞数比较多的原因？
FindClusters()的resolution=0.6。- 细胞注释：marker基因见下图
a：鉴定上皮细胞使用的marker；b：鉴定免疫细胞使用的marker。
- ❗️图b展示细胞比例的方法比普通的堆叠条形图要直观一些，不知道是怎么画出来的，后续研究一下。
2. Dynamics of epithelial differentiation upon SARS-CoV-2 infection.
正常情况下，基底细胞（basal cells, TP63+/KRT5+）可以分化为分泌细胞（secretory cells），分泌细胞再分化为纤毛细胞（ciliated cells）。这个过程由FOXN4细胞介导（图a,b,d中的Different path 1）。驱动这一过程的转录因子包括FOXJ1和TCTEX1D2。
在刺激或损伤的情况下，基底细胞直接分化为纤毛细胞，绕过了分化成分泌细胞这个阶段（图a,b,d中的Different path 2）。参与了这个过程的基因包括cytokeratins (KRT4 and KRT7)和细胞纤毛组成基因 (IFT43)。
此外，该研究预测出了一条新的分化途径different path 3。该过程由IFNG-反应性细胞介导不成熟的分泌细胞直接分化为纤毛细胞，并有干扰素刺激基因（ISG）如ISG15, IFIT1 和 CXCL10的参与。
这个monocle3的图出的好好哦，但是！感觉就算我的结果出成这样，我也不能解读的这么好，这大概就是我跟nature biotechnology的差距吧。。。
- 这一部分用到的分析主要是在做比对的时候额外比对了一个特制的参考基因组，SARS-CoV-2基因组（Refseq-ID: NC_045512）作为额外的染色体被加入了human reference genome hg19。An entry summarizing the entire SARS-CoV-2 genome as one ‘gene’ was appended to the hg19 annotation gtf file, and the genome was indexed using ‘cellranger_mkref ’.⚠️
- 上图所展示的拟时序分析是
monocle3做的(参考：monocle3)，所以他的图a(细胞注释图)和图b(拟时序图)可以是一样形状的umap图，这也是monocle3和monocle2相比的一个大改进。但Monocle3只是用来画了轨迹图，作者算拟时基因还是用monocle2(To identify genes that are significantly regulated as the cells differentiate along the cell-to-cell distance trajectory, we used the differentialGeneTest() function implemented in Monocle2)
⚠️d图也是用monocle2画的，是把三个path的细胞分开，然后用ggplot2分别画的density图。
3. Variable ACE2 expression in the upper airway epithelium.
SARS-CoV-2通过结合宿主ACE2受体和S蛋白感染上呼吸道黏膜，通过细胞蛋白酶TMPRSS2或FURIN的协同作用进入细胞。和正常对照相比，COVID-19患者的SCE2和协同蛋白（蛋白酶TMPRSS2或/和FURIN）的表达水平增加了三倍(Sup1b)。尽管感染后ACE2+的纤毛细胞数目没有增加，总的ACE2+细胞数目增加了，提示机体对新冠的易感性增强。
大多数的纤毛细胞是ACE2+/TMPRSS2+，分泌细胞和FOXN4+细胞是ACE2+/TMPRSS2+/FURIN+。在被SARS-CoV-2感染的细胞感染的细胞中，分泌细胞和纤毛细胞占了最多的比例（下图d）。此外，每百万（CPM）reads中检测到的病毒转录本在所有的COVID-19患者中都相当低，且大多数都是在出现症状前11天检测到（下图e）。
4. Immune cell–epithelial cell interactions increase infectability of epithelial cells.
SARS-CoV-2感染让人比较困惑的一个问题是正常人群呼吸道ACE2+受体细胞数目相当少。我们的研究发现，感染后一个上皮细胞亚群的ACE2表达量增加了三倍（上上图sup1b）。此外，ACE2+的纤毛细胞和分泌细胞百分比和这些细胞与细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）之间的互作（配体受体表达）呈现相关性（下图）。此前的研究提示，ACE2的表达是干扰素反应性的。我们的研究发现，干扰素反应的一个核心转录因子STAT1是ACE2表达的良好预测指标之一，这进一步证实了先前的研究结论。CTLs高表达IFNG，分泌细胞和纤毛细胞表达IFNG的受体IFNGR1和IFNGR2，提示免疫细胞的IFNG信号通路（至少是部分）参与了上皮细胞ACE2表达的上调。
5. Immune-mediated epithelial damage in severe COVID-19
在病毒感染的部位，被感染的上皮细胞分泌趋化因子，招募和活化不同的免疫细胞群。和对照组相比，中度COVID-19患者的分泌细胞明显高表达趋化因子配体CXCL1, CXCL3, CXCL6, CXCL16和CXCL17（下图中）。纤毛细胞高表达CCL5，可能通过CCR1参与了单核巨噬细胞和中性粒细胞招募。和中度患者相比，重症患者不同细胞群趋化因子和趋化因子受体的表达显著增加（下图下），提示感染部位免疫细胞招募增强。
细胞互作结果显示，如下左图，中度患者的纤毛细胞和分泌细胞与各种免疫细胞（包括CTLs, CTLs, CD4T/Tregs, B细胞, 非原驻巨噬细胞 (nrMa), 单核来源的巨噬细胞 (moMa) 和中性粒细胞）的相互作用可能反应了有效清除病毒感染的内皮细胞时必要和适度的免疫反应（下左图）。和中症患者相比，重症患者各种细胞之间的互作显著增强，尤其是CTL，nrMa和moMa（下右图）。
重症患者更多的上皮-免疫细胞互作与nrMa，moMa和CTL更高的激活状态相一致。nrMa的各种趋化因子编码基因CCL2 (编码MCP1), CCL3 (编码MIP1α), CCL20, CXCL1和CXCL3，以及各种促炎细胞因子IL1B, IL8, IL18和TNF表达显著增加。moMa主要表达CCL2, CCL3和CXCL10，而重症COVID-19患者CCL3表达也增强（下图c）。值得注意的是，增加的CCL2和CCL3表达和中性粒细胞、CTLs、不同的巨噬亚群显著增加的CCR1(编码的受体可与MIP1a和MCP1相结合)表达相对应（下图d）。在中度症状患者中，CTLs显示出抗病毒的CD8+T细胞的表达谱，高表达IFNG, TNF, CCL5和PRF1 (编码穿孔素perforin) 以及GZMB和GZMA (编码颗粒酶granzymes) 还有编码cytotoxic receptors的基因(KLRB1, KLRC1和KLRD1)。重症患者的CTL低表达CCL5, IFNG和TNF但表现出更强的胞溶功能（下图c）。
随后对上下呼吸道都采集了样本的两组配对样本进行了分析（都是重症的），显示下呼吸道免疫反应更强。
这一部分的细胞互作分析都是cellphonedb做的，参考：cellphonedb
6. Patient-specific inflammatory profiles.
因为患者样本采的是不同时间点的，所以这部分选了四个不同严重程度（12，07，06，02）的样本进行了分别分析，以探究整个发病时程。
中度12患者和重度初期07患者表达谱类似，而06和02两个严重的患者CCL20, CXCL5, CXCL3, CXCL1, CCL和CCL2表达增加，TNF和IL1B表达也增加。对极重的02患者，上述细胞因子表达更高。
免疫细胞的溢出、招募外周血单核细胞到受感染或损伤的部位以及它们沿着内皮迁移是早期机体对抗病毒感染的重要免疫防御机制。很多分子参与了单核细胞穿越血管壁的迁移（monocyte trafficking）。评估不同COVID-19严重程度下溢出级联反应（extravasation cascade）的marker表达，结果显示这些基因在nrMa中出现了显著的增强。ITGAL (编码CD11a), ITGAM (编码CD11b), ITGAX (编码CD11c), ITGB1 (编码CD29)和ITGB1 (编码CD18) 以及LFA-1, Mac-1和VLA-4这些基因都在单核细胞穿越内皮细胞过程中起到重要作用。
和中症12号患者相比，06患者出现了明显的ITGAM, ITGAX, ITGB2和ITGB1表达增加。这与表达CD44（机体免疫防御的关键介质）的细胞比例增加相一致。此外，ICAM1和VEGFA（通常由上皮细胞表达以招募白细胞）在单核细胞表达增加，显示单核细胞可以也招募单核细胞。增加的溢出marker的表达也预示着增强的抗病毒反应和因此引起的内皮和上皮屏障等的破坏
这部分值得注意的是：
Extravasation cascade这个概念和extravasation相关基因的变化及其解读。⚠️
创新点：
- 同时提供了上下呼吸道的细胞水平研究。同一时间点同一患者上下呼吸道的对比，显示下呼吸道出现了免疫过度活化表型。
- 免疫细胞和上皮细胞之间的互作可能引起了过度免疫活化介导的组织损伤、肺损伤和呼吸衰竭。（主要依赖于细胞互作分析）
- 对整个病程不同时间点的样本进行了分析。