4 、天闲星 入云龙 公孙胜
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发表时间：2020年5月
期刊：Genome Medicine (IF:10.675)
单位：韩国成均馆大学
技术手段：10x Chromium单细胞、WES、转录组测序、PDX模型
前言
肌肉侵袭性尿路上皮膀胱癌(MIUBCs)具有临床侵袭性和致命性，由于其全身扩散的可能性很高，且缺乏完善的治疗指南，MIUBCs的 5年相对生存率只有5%。MIUBCs存在瘤内和瘤间异质性(遗传、分子和微环境)，且TME会导致MIUBCs的治疗失败和肿瘤进化，因此针对肿瘤细胞内在机制和复杂相互作用的个性化干预设计成为必要。
传统的bulk测序在解决肿瘤细胞亚群和解析TME的能力上存在局限性，而scRNAseq技术可以对治疗后残留的肿瘤细胞和周围基质中肿瘤相关的非恶性细胞的基因模块进行高分辨率分析，解剖关键药物靶点途径，以设计针对肿瘤细胞和TME的定制联合治疗方案。PDXs中的基质和免疫细胞成分可用于模拟人类肿瘤组织TME，基于PDX模型的物种特异性分析是区分TME(小鼠)和肿瘤细胞(人)的最简单方法之一。在本研究中，研究人员切除了一位化疗耐药的转移性MIUBC患者的原发肿瘤并构建PDX模型，利用scRNA-seq深入分析了难治性癌症的多种机制，为针对癌基因依赖之后制定的一种规避肿瘤进展的治疗选择提供了重要线索，并在患者中成功应用。
结果
1、 患者临床信息
病人为49岁男性患者，第一次经尿道膀胱肿瘤切除术诊断为非肌肉侵袭性膀胱移行细胞癌（non-MIUBC）(pT1, high grade)，第二次经尿道膀胱肿瘤切除术发现肿瘤已经进展为肌肉侵袭性膀胱移行细胞癌（MIUBC）(pT2, high grade)，经过多种新辅助化疗（吉西他滨/紫杉醇、连续紫杉醇）后，出现局部复发和多发性肺转移,表明肿瘤进展为铂难治转移性MIUBC，对其有效的全身治疗选择有限。三次手术获得的样本分别编号为BC159-T#1、BC159-T#2、BC159-T#3（下图）。
2、 实验设计
BC159-T#1、BC159-T#2两个样本用于做全外显子测序和转录组测序，BC159-T#3样本一部分用于做全外显子测序和转录组测序，一部分解离为单细胞用于单细胞测序和PDX模型构建，荷瘤小鼠(100-150mm3)随机分为替吡法尼(50mg/kg，灌胃，每日2次)组和对照组，治疗20天，实验结束时收集各组肿瘤用于单细胞测序等其他分析（下图）。
3、 临床样本信息分析
转录组测序和IHC发现样本BC159-T#1富集luminal–papillary肿瘤亚型基因信号（例如CK13），BC159-T#2和BC159-T#3表现出basal/squamous 肿瘤亚型特征（例如CK5/6和CK14），这些数据与已知的MIUBC从管腔亚型到基底鳞状亚型的进展路径一致，这表明肿瘤通过增加stemness和上皮-间充质过渡(EMT)增强了临床侵袭性（下图）。
为了识别肿瘤进化树中普遍存在的癌基因依赖和驱动突变，对BC159-T#1~#3进行全外测序（WES）进行SNP分析和CNV分析，并使用OncoKB数据库对这些突变做了靶向药物注释。
三个样本中HARS表现出最高程度的变异等位基因频率（VAF）,并伴随HRASQ61R突变蛋白高表达和RAS通路高度激活，单细胞测序进一步表明HRAS在肿瘤细胞高表达，提示HRASQ61R是这例晚期难治性病例中驱动肿瘤发展的主要因素。**
4、 阻断HRASQ61R活化后治疗效果的临床前验证及临床应用
为了验证靶向HRAS的治疗可能是患者的临床选择，使用了BC159-T#3皮下PDX模型开展替吡法尼临床前验证：当替吡法尼(50mg/kg口服，每天两次)在药理上抑制HRAS激活时，肿瘤生长明显受到抑制、HRAS介导的ERK和AKT激活降低、细胞增殖减少、凋亡增加
备注：替吡法尼是一种高效选择性法尼基转移酶抑制剂(FTI)，通过显著衰减法酰化介导的HRAS信号，对含有突变HRAS的晚期MIUBCs特别有效
基于替吡法尼具有良好的临床前抗肿瘤疗效，患者经膀胱部分切除术后参加了替吡法尼II期临床试验，经治疗后患者膀胱、左肾盏及肺转移肿瘤负荷明显减轻(部分缓解）。但是遗憾的是，与PDX临床前试验中替吡法尼未能完全缓解肿瘤一致，患者消散性肿瘤在9个月后开始再生（下图）。（PS: 小编建议可以尝试类器官这个技术，目前主流科学界认为它优于PDX模型）
5、 scRNA-seq阐明靶向HRAS单治疗后肿瘤耐药的细胞内在因素
通过对PDX样本（替吡法尼处理前后）单细胞测序，将肿瘤细胞分为A、B两个cluster，其中替吡法尼治疗后，肿瘤细胞中HRAS以及RAS、MAPK通路相关基因表达下调，蛋白水平（单细胞WB）证明HRAS介导的信号通路受抑制。
有意思的是，替吡法尼耐受肿瘤细胞处于细胞休眠状态（非增殖细胞比例增加），这有助于抵抗靶向细胞增殖的药物。耐药肿瘤细胞中，胰岛素样生长因子结合蛋白7 (IGFBP7)、肝素结合细胞因子(MDK)和beta -2微球蛋白(B2M)基因的转录和翻译表达水平升高（下图）。
为证明治疗开始前肿瘤组织就存在假定的替吡法尼耐受肿瘤细胞，对治疗前肿瘤样本（BC159-T#3）进行单细胞分析，发现治疗前肿瘤细胞可聚类为3个cluster，其中cluster3表现出HRAS转录下调、细胞休眠和IGFBP7、MDK、B2M 高表达（下图）。
6、单细胞测序分析TME对替吡法尼获得性耐药的贡献
治疗诱导的TME改变会为癌细胞生成一个保护小生境，进而促进肿瘤复发和进展。为了阐明TME因素对替吡法尼耐药的诱导，研究人员采用单细胞测序分析了PDX组小鼠在替吡法尼处理前后TME的变化，聚类分析发现小鼠PDX的TME成分包括成纤维细胞、单核细胞/巨噬细胞、T细胞和B细胞以及自然杀伤(NK)细胞。
虽然替吡法尼引起的整体细胞成分改变很小，但对每个细胞成分的详细分析揭示了替吡法尼治疗后特定细胞亚型的改变。成纤维细胞包括癌相关成纤维细胞(CAFs，表达COL14A1)和癌相关肌成纤维细胞(MyoCAFs，表达ACTA2)，替吡法尼治疗后MyoCAFs的数量增加，而MyoCAFs通常与肿瘤的侵袭性和不良预后有关，对照组含有更多的CAFs。差异基因分析发现，Mdk和Igfbp7（与替吡法尼耐受相关的肿瘤内在因子）在替吡法尼处理组成纤维细胞高表达，这意味着这两个靶点在休眠肿瘤细胞中起关键作用，MyoCAF亚群与肿瘤细胞的互作可能有助于肿瘤对替吡法尼的耐药性（下图）。
另外发现，替吡法尼治疗导致巨噬细胞总数和比例显著增加，伴随M1样巨噬细胞减少和M2样巨噬细胞增加；处理组中耗竭型CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和自适应NK细胞增多，表达IgM的B细胞减少。总的来说，替吡法尼诱导的TME特征是促肿瘤的MyoCAFs浸润增加，免疫细胞受抑制，例如M2巨噬细胞增加和CTLs耗竭（下图）。
对BC159-T#3临床肿瘤样本TME进行单细胞数据分析，发现临床样本细胞构成与PDX模型TME类似。重要的是，在BC159-T#3中，存在包括Navie到激活状态的CTLs和 Tregs细胞。激活的CTLs和Tregs均表达不同水平的免疫检查点基因，如CTLA4、LAG3、PDCD1TIGIT。综合临床样本数据和PDX模型替吡法尼治疗前后数据，预示抑制肌成纤维细胞和抗炎巨噬细胞，或重新激活T细胞免疫，可以考虑作为治疗抗替吡法尼MIUBC的策略。
7、 针对替吡法尼治疗后肿瘤复发的个体化抢救方案
目前还没有通过抑制MDK和IGFBP7共同靶向休眠肿瘤细胞和MyoCAFs的治疗方法。然而PD-1)/PD-L1抑制剂被批准用于晚期化疗难治性MIUBC的二线治疗，BC159-T#3中浸润的耗尽CTLs和Tregs中过表达PD-1/PD-L1，因此PD-1/PD-L1抑制剂在临床上可能是有效的。
BC159-T#3中肿瘤细胞和多种基质/免疫细胞之间存在细胞通讯网络，肿瘤细胞表达的PD-L1 和PVR转录本分别通过PD-1 和TIGIT向 T细胞传递抑制信号。BC159-T#3样本中PD-1表达位居TCGA-BLCA数据集的前3.16%，与其他亚型(特别是含有HRAS突变的亚型)相比，基底亚型中PDL1的表达较高，进一步证实了BC159-T#3中PD1高表达。由于PDL1的高表达水平可以预测对PD-1/PD-l1抑制剂的良好临床反应，因此对替吡法尼治疗失败的患者使用人源化的单克隆PDL1抗体阿特唑珠单抗作为替吡法尼治疗后复发肿瘤的下一个优化治疗选择，成像显示，如预期的那样，受试者对阿特唑珠单抗有部分反应。
结论
由于过程复杂且昂贵，PDXs构建和scRNA-seq目前还无法应用于实际临床。即使在极少数成功应用的情况下，因为病人的健康迅速恶化，导致无法分析潜在的联合治疗策略的临床反应，这些局限性使得本研究更有价值，因为此研究基于PDX和scRNA-seq数据来确认治疗选择的有效性。更重要的是，本文的发现可能对携带HRAS突变的癌症患者具有普遍的适用性。本文的发现显示了在传统单一疗法治疗失败后，scRNA-seq发现新的精确治疗方案的潜力，也为临床上一系列难治性晚期癌症的有效个性化治疗提供了新的见解。
原文链接：单细胞测序如何指导临床问题？看这篇paper就够了