细菌基因组的组装

一、获取SRA号

登录Genome Announcements网站（https://mra.asm.org/），搜索关键词“bacteria genome SRA”，在搜索到的细菌基因组文章中选择一篇，找到文章记载的SRA号。

以下面文章中的SRR号 SRR6466501 为例：

SRR6466501.JPG

二、下载SRA文件

SRA (Sequence ReadArchive)数据库，是用于存储二代测序的原始数据，包括454, Illumina, SOLiD, lonTorrent, Helicos 和CompleteGenomics。除了原始序列数据外，SRA现在也存在raw reads在参考基因的比对信息。
根据SRA数据产生的特点，将SRA数据分为四类：Studies-- 研究课题、Experiments-- 实验设计、Runs-- 测序结果集、Samples-- 样品信息。
SRA文件，SRA数据库用不同的前级加以区分：
●ERP或SRP表示Sudics;
●SRS表示Samplo;
●SRX表示Hxpcritmcrnt;
●SRR表示Runs;

从SRA数据库上用prefetch下载sra文件，输入命令如下：

prefetch SRR6466501    #下载

结果如下：

软件自动建立~/ncbi/public/sra文件夹，查看：

三、 Fastq-dump解压

cd ~/ncbi/public/sra    #进入到sra文件夹下

fastq-dump --gzip --split-files SRR6466501.sra    #解压

结果如下：

四、Fastqc质控

*准备：Fastqc安装，可参考我的https://www.jianshu.com/p/e0659f09288c

使用以下命令进行质控：

fastqc SRR6466501_1.fastq.gz

fastqc SRR6466501_2.fastq.gz

结果：

FastQC报告
打开：SRR6466501_1_fastqc.html
SRR6466501_2_fastqc.html

五、Trimmomatic去接头

切除接头序列和低质量碱基，此处使用数据过滤软件Trimmomatic。

Trimmomatic 是一个广受欢迎的Ilumina平台数据过滤工具。
处理数据速度快，主要用来去除Illumina 平台的Fastq序列中的接头，并根据碱基质量值对Fastq进行修剪。
支持多线程，有两种过滤模式，分别对应SE和PE测序数据。
用法：
单末端测序模式
在SE模式下，只有一个输入文件和一个过滤后的输出文件
java -jar [Trimmomatic所在的绝对路径] SE-phred33 [输入文件] [输出文件] [动作1] [动作2]......
双末端测序模式
在PE模式下，有两个输入文件,正向测序序列和反向测序序列，过滤之后，输出文件有四个两端序列都保留的为paried -端序列过滤后被遗弃另- -端保留为unparied
java jar [Trimmomatic的绝对路径] PE -phred33
第一个输入文件(forward端)正向端
第二个输入文件(reverse端)反向端
输出文件[forward_ paried forward_unpaired reverse_ paired reverse_ _unpaired ] [动作1] [动作2]......
另外也支持phred-33和phred-64格式互相转化，不过现在绝大部分Illumina平台的产出数据都转为使用phred-33格式了。

*准备：Trimmomatic安装：

unzip Trimmomatic-0.38.zip
cd Trimmomatic-0.38         
java -jar trimmomatic-0.38.jar

Trimmomatic过滤命令如下：

java -jar /home/gxx/Trimmomatic-0.38/trimmomatic-0.38.jar PE -phred33 SRR6466501_1.fastq.gz SRR6466501_2.fastq.gz ./output_forward_paired.fq.gz ./output_forward_unpaired.fq.gz ./output_reverse_paired.fq.gz ./output_reverse_unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:/home/gxx/Trimmomatic-0.38/adapters/TruSeq2-PE.fa:2:30:10 SLIDINGWINDOW:5:20 LEADING:20 TRAILING:20 MINLEN:75

结果如下：

动作说明
ILLUMINACLIP:
过滤reads中的Illumina测序街头和引|物序列并决定是否去除反向互补的R1/R2中的R2
参数说明( PE测序要注意最后-一个参数, SE最后两个参数不用设置,参数之间用冒号连接)：
<接头和引物序列所在位置( Trimmomatic自带在adapters里面,其中TruSeq2为2代测序, TruSeq3为三代测序)> :
:::
:

SLIDINGWINDOW:
从reads的5'端开始,进行滑窗质量过滤,切掉碱基质量平均值低于阈值的滑窗
参数说明: <窗口大小>: <碱基平均质量值阈值>
MAXINFO:
一个自动调整的过滤选项，在保证reads长度的情况下尽量降低测序错误率,最大化reads的使用价值
LEADING:
从reads的开头切除质量低于阈值的碱基
TRAILING:
从reads的末尾切除质量低于阈值的碱基
CROP:
从reads的末尾切掉部分碱基是reads达到指定长度
HEADCROP:
从reads的开头切掉指定数量的碱基
MINLEN:
如果经过剪切后reads的长度低于阈值则丢弃这条reads
AVGQUAL:
如果reads的平均碱基质量值低于阈值则丢弃这条reads
TOPHRED33:
将reads的碱基质量值体系转为phred-33
TOPHRED64:
将reads的碱基质量值体系转化为phred-64

六、SPAdes组装基因组草图

SPAdes:
➢由俄罗斯科学院圣彼得堡理工大学计算生物学实验室开发，是目前评价最好的拼接工具之一。
➢主要用于基因组拼接，也可用于一、二、三代测序的混合组装;还可用于转录组从头组装(rnaSPAdes)和宏基因组拼接(metaSPAdes) 。

*准备：SPAdes的安装
python环境下，安装命令如下：

wget http://cab.spbu.ru/files/release3.12.0/SPAdes-3.12.0-Linux.tar.gz
mkdir ~/Biosofts/spades
tar zvxf /home/gxx/SPAdes-3.12.0-Linux.tar.gz -C ~/Biosofts/spades/
~/Biosofts/spades/SPAdes-3.12.0-Linux/bin/spades.py -h
echo 'export PATH=~/Biosofts/spades/SPAdes-3.12.0-Linux/bin:$PATH' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
spades.py -h

SPAdes运行：

spades.py --careful --pe1-1 SRR6466501_1.fastq.gz --pe1-2 SRR6466501_2.fastq.gz -o ./SPAdesout_SRR6466501new

遇到错误：out of memory，内存不足。

解决：将虚拟机设置中的系统内存调至合理范围内最大，再次尝试以上命令，但最终还是不行。。

尝试使用seqtk抽取1000条，命令如下：

#解压
gunzip -c output_forward_paired.fq.gz >output_forward_paired.fq
gunzip -c output_reverse_paired.fq.gz >output_reverse_paired.fq
#抽取1000条
seqtk sample -s 60 output_forward_paired.fq 1000 >seqtksample1_1000.fq
seqtk sample -s 60 output_reverse_paired.fq 1000 >seqtksample2_1000.fq
#用wc查看，可对比前后文件，判断是否抽取成功
wc -l output_forward_paired.fq
wc -l seqtksample1_1000.fq

然后，再次尝试SPAdes运行：

spades.py --careful --pe1-1 seqtksample1_1000.fq --pe1-2 seqtksample2_1000.fq -o ./SPAdesout_SRR6466501_1000new

结果如下：

七、Quast评价组装的基因组效果

*准备：Quast的安装，安装命令如下

tar zvxf quast-5.0.0.tar.gz -C ~/Biosofts/
~/Biosofts/quast-5.0.0
python quast.py -h

运行代码：

quast.py ~/ncbi/public/sra/SPAdesout_SRR6466501_1000new/contigs.fasta -o ~/ncbi/public/sra/SPAdesout_SRR6466501_1000new/quast_out

结果如下：

查看输出的文件夹quast_out：

本地下载quast报告 report.html，并查看：

完成！！！