晓颖_9b6f
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文献：《PRMT2 and ROR?Expression Are Associated With Breast Cancer Survival Outcomes》

文献：《PRMT2 and ROR?Expression Are Associated With Breast Cancer Survival Outcomes》

解读的目的：积累癌症的背景知识+该文章的研究目的--用到什么分析---结果的图如何解读---最后看看能不能复现一下代码。

一些名词的释义：

  • PRMT2：Proteinarginine methyltransferases蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）甲基化组蛋白上的精氨酸残基和在许多细胞过程中起关键作用的靶转录因子。蛋白质精氨酸甲基化由 PRMTs 调控，常见的一种翻译后修饰，已知的 PRMTs 家族有9种（PRMT1、PRMT2、PRMT3、PRMT6、PRMT8、CARM1、PRMT5、PRMT9、PRMT7），分别催化形成单甲基化（MMA），对称二甲基化（SDMA）和非对称二甲基化（ADMA）。近些年的研究证明了 PRMTs 调控了表观遗传介导的基因表达、mRNA 剪接、DNA 损伤应答、干细胞功能以及免疫反应等与肿瘤发生发展密切相关的生物学过程

  • RORγ：

  • MCF-7 cancer cell ：人乳腺癌细胞。MCF7细胞保留了多个分化了的乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成圆形复合物。MCF7细胞含有Tx-4癌基因；肿瘤坏死因子α可以抑制MCF7细胞的生长，抗雌激素处理MCF7 细胞能调变IGFBP'S的分泌。

  • IDC：Invasive Ductal Carcinoma 浸润性导管癌

  • DMFS：无远处转移生存率(DMFS)总生存率(OS)

前言：

研究目的：PRMT转移酶可以使得组蛋白的精氨酸残基和靶转录因子甲基化，在基因转录、mRNA剪接等过程中是有作用的。最近有研究表明PRMT依赖性的表观遗传标记和肿瘤发生和转移是有相关性的。但是PRMT2依赖性信号在乳腺癌中的作用仍不清楚。所以作者的目的是要研究PRMT2依赖性信号在乳腺癌中的作用。

前人的几个研究：

  • 1998年发现了PRMT2

  • 表现出弱I型精氨酸甲基转移酶活性

  • PRMT2可以作为转录辅因子，参与许多类固醇激素/核受体的转录活动，包括雌激素受体（ER）、维甲酸受体和雄激素受体

  • PRMT2还被发现参与β连环蛋白介导的基因基因表达

  • PRMT2影响参与细胞程序性死亡和脂多糖诱导炎症反应的核因子-B信号通路

  • PRMT2与如异质核核糖核蛋白腺病毒早期1B区相关蛋白（E1B-AP5）有相互作用

  • PRMT2与视网膜母细胞瘤蛋白相互作用

  • PRMT2的减少以雌激素依赖的方式增加E2F转录因子1（E2F1）的表达，并改变E2F1依赖基因的表达

  • PRMT2表达的增加被证明与ER阳性相关，表明PRMT2在雌激素介导的信号传导中的潜在作用以及可能参与乳腺癌的病因和进展

研究方法和分析

  • 购买-培养MCF-7 细胞

  • siRNA实验-siRNA转染MCF-7细胞48小时

  • 微阵列数据分析：对照和PRMT2敲除RNA样本之间的差异表达基因正常化

  • MCF-7细胞的RNA提取分离----反转录---RT-qPCR

  • WB实验，蛋白印迹

  • 乳腺癌微阵列数据集分析：做生存分析。包括有54个公开的乳腺癌数据

  • 蛋白相互作用检验。用PPI network

  • WGCNA 和GO分析

  • 乳腺癌组织样本的TLDAs and RT-qPCR

  • 用TLDA进行NR表达谱分析

  • 伤口愈合迁移试验

  • DNA修复分析：紫外线损伤分析+绿色荧光蛋白（GFP）分析

得出来的结果：

1、与正常乳腺组织相比，PRMT2在人类乳腺癌中显著降低。

作者采用了（66个样本的IDC tissues---50个正常乳腺组织的样本）的PRMT2 mRNA表达量的比较。

从图里面可以看到的是，乳腺癌的PRMT2表达量确实比正常乳腺组织的要低。

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2、、PRMT2依赖性基因表达调节乳腺癌中涉及的多种途径（包括细胞周期和DNA修复）

作者为了验证PRMT2缺失对MCF-7细胞的影响。用siRNA转染MCF-7细胞48个小时。干扰PRMT2，使其沉默。+microarray analysis。

作者做了一系列的比对实验来证明：

  • PRMT2缺失，对TP53影响不大

  • PRMT2缺失，p21mRNA表达量增加

  • PRMT2缺失，cyclin D1mRNA表达显著减少

结果1：显示的，正常细胞和PRMT2-siRNA比较。是证明转染成功的，PRMT2已经被干扰沉默了。

WB也是证明了这点。PRMT2的蛋白水平也是降低的了。

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结果2：观察到PRMT2-siRNA-1显著减弱所有8种异构体的表达

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结果3：差异化分析（筛选条件：>2-foldchange, P<.05)

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结果4：前10个上调和下调基因。其中PRMT2在里面

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结果5：通路分析。

Ingenuity通路分析显示PRMT2依赖基因参与多种功能和细胞通路，包括细胞周期控制、DNA复制/修复和致癌。

IPA（Ingenuity Pathway Analysis，通路分析软件）是一款基于云计算的图形化界面生物信息学软件，能够从生物学通路角度将组学数据进行分析。

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结果6：重要的上游调节因子。

CCND1、TP53、 CDKN1A (p21)

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结果7：接着做RT-qPCR。

目的是想对结果6的上游调节因子进一步的验证。

结果是显示。敲除了PRMT2的MCF-7细胞和正常细胞对比。

①、TP53并没有明显的显著的变化

②、p21mRNA levels上升了。protein expression也上升了。

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结果8：作者同时也用了其他的细胞系进行一样的实验。

T47D（ER+ve）

MDA231 ER-ve

主要是观察p21的变化。

[图片上传失败...(image-102364-1632408370943)]

结果9：其他的一些验证实验。

也都是证明了PRMT2的缺失也导致p21 mRNA表达显著增加

结果10：相同的实验，也是去证明了。PRMT2的缺失会导致cyclin D1mRNA表达显著减少

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  • PRMT2依赖性基因表达调节乳腺癌中涉及的多种途径（包括细胞周期和DNA修复）

3、ppi网络

作者的目的是想通过画出ppi网络，来确认PRMT2调节基因是否形成了具有定义生物学功能的基因的互连子网络。

作者是用了一个“a fast heuristic search algorithm capable”更快的算法？FDR是0.01

结果是：确定了一个重要的子网络，包括499个基因（节点）和5517个基因之间的连接。而且在这个子网络中，发现一组高度互联的PRMT2下调基因的网络。这一组基因是动粒和DNA修复途径的核心成员。

  • 红色圈出部分是PRMT2依赖基因的蛋白质相互作用图。总图

  • 下面的具体的子网络图是：动粒和DNA修复途径的基因之间的关键功能相互作用

  • 红色表示PRMT2敲除细胞中的上调，而蓝色表示PRMT2敲除细胞中的下调

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同时还通过qPCR对ABL1,AURKB,BRCA1,CCNB1,CDK1, SKP2等几个差异表达的关键基因进行验证。

结果是表明了这几个基因确实是存在差异表达。

ABL1是显著上调，其他的几个是显著下调。这些通路在癌症中是会被解除的，与染色体不稳定和侵袭性的乳腺癌有关。

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三、PRMT2表达调节核受体（NRs）、肝受体同源物-1（LRH-1）和雄激素受体γ的表达，并影响乳腺癌细胞迁移：PRMT2和RORγ在乳腺癌中呈负相关。

1、在图2B，里面，是可以看到。在PRMT2沉默的MCF-7细胞中。编码RORγ的mRNA表达显著增加。top10之一。ROR是属于NR家族的。

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然后提取整个NR超家族的表达。如图： fold change用的是log10 ，而不是log2。倍数还挺大的了。

变化最大的两个是：RORγ和LRH-1

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作者然后有做了一个验证实验；TLDA，（低密度基因芯片 (TLDA)实验）没了解过这个怎么做的。

也还是证明了。RORγ和LRH-1的上调和下调确实变化很大。

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结果：证明了PRMT2的沉默会使得RORγ的上调，而前人的研究已经证明了RORγ表达已被证明与人类乳腺癌的转移呈负相关。也就是说PRMT2表达水平影响乳腺癌细胞迁移

2、伤口愈合试验表明，PRMT2缺失的MCF-7细胞迁移减少

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3、作者还利用了50 breast cancer的样本去验证PRMT2和RORγ之间是否存在相关性。

结果是： ER+ve patients中是存在相关性的，但是ER-ve样本中就是不存在的。

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4、乳腺癌患者的RORγ表达增加会增加DMFS

作者为了进一步评估RORγ表达对转移性乳腺癌患者临床预后的影响。所以对这些数据进行了一个K-M生存分析。

三个数据：breast cancer、MAINZ、UNC

结果：都是是RORγ高表达的，病人会有更好的生存率。

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然后再做一个 HR analysis？？？？（没接触过）

使用95%置信区间和Cox回归

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做这个 HR 分析的结果也是：

  • 高RORγ表达会增加病人的生存率
  • 高PRMT2表达，会降低病人生存率。

四、在人类乳腺癌队列中，PRMT2依赖性基因与生存结果DMFS显著相关

作者在这一步，想再验证一下，整个-PRMT2依赖性基因和DMFS是否有关联，和上一步的结果是否能相互验证。

用到的三个数据集：NKI, TRANSBIG, UNT

第一个：所有的PRMT2依赖性基因和DMFS的相关性。

结果是:低PRMT2表达，确实会增加病人生存率dmfs。（红色的线）

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第二个：PRMT2-down下调的基因和DMFS的相关性

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第三个：PRMT2-down上调的基因和DMFS的相关性

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五、加权基因共表达网络分析识别与乳腺癌生存相关的共表达基因集和转录模块

WGCNA是一种识别高度相关基因模块的方法，作者用WGCNA应用于乳腺癌表达数据，想去检测和乳腺癌中PRMT2表达相关的转录回路模块。

结果是：

①、生成7个模块。每一个模块是1-2个通路的集合。模块7是：细胞周期检查点、有丝分裂细胞周期控制。模块3是：细胞外基质和细胞粘附显著相关。

②、可以看到的是：在通路模块1、2、6、7里面：PRMT2和RORγ之间存在负相关

③、癌症的转移和增值的特性相对应的泛癌基因包括有：①、和EMT相关的基因、②、和染色体不稳定的动粒等相关的基因。

而这些基因和通过WGCNA分出来的七个模块里面的红色模块7、紫色模块3的基因是高度重合的。

--也就是说，PRMT2和RORγ在这两个泛癌基因模块里面，是存在负相关的。

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右图C是如何做的？

作者是：用了两种方法：

①、GO terms和模块基因之间的重叠的超几何测试？？？ ②、基因集富集分析，以测量GOterms是否显示模块关联的一致趋势？？？？？

还有这个图是怎么看的？怎么画的？不知道。

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2、作者通过前面，确定了模块7的重要性，现在想进一步去探究模块7的基因和临床是否有关，做了一个生存分析。

高表达的模块7基因，确实是会降低生存率。

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后面作者继续做了比较分析。PRMT2-down的基因的生存分析。可以看出是，PRMT2下调信号升高，会降低生存率。

[图片上传失败...(image-c60032-1632408370942)]

最后，作者再进一步去探究：PRMT2和管腔A亚型---管腔B亚型，谁的影响

更大。

结果：与管腔A肿瘤相比，管腔B肿瘤中PRMT2down标记基因的平均表达显著高于管腔A肿瘤。

五、PRMT2缺失增强紫外线诱导DNA损伤的修复

作者在PPI相互作用组和WGCNA分析PRMT2耗竭后的DNA修复途径。所以作者想验证一下，PRMT2是否对DNA损伤的修复有影响？

作者用紫外线诱导MCF-7细胞，

结果，直接看48小时的，PRMT2表达降低改善了紫外线照射后CPD损伤的清除。也就是说PRMT2缺失增加了MCF-7乳腺癌细胞的DNA损伤修复

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六、讨论，结论

  • PRMT2在人类乳腺癌中显著降低

  • PRMT2缺失减少细胞迁移

  • PRMT2与RORγ表达呈负相关

  • PRMT2依赖性基因表达影响无转移生存

  • PRMT2依赖性基因子集参与细胞周期检查点、有丝分裂细胞周期控制的G1/S转换和DNA修复。这些回路与EMT、增殖和CIN相关的泛癌基因特征相关，并包括动粒相关基因

自己的一些想法：

1、背景知识的缺乏。我这样学生信的话，实验室的课题只有环境DNA的，也就是和宏基因组差不多的。除了这个切入点，但是这个环境DNA的是太偏门了，找工作不好找。我还是的另选一个切入点去学习。癌症应该是生信里面一个比较热门的课题得了。

如果我要以癌症作为切入点去学生信，那我就得补很多很多的背景知识。缩小一点，乳腺癌作为切入点？

2、，大概可以摸清作者的思路

①、先确定了PRMT2在人类乳腺癌中显著降低

②、然后做差异分析、通路分析，和多个实验，去确定了PRMT2依赖性基因表达调节乳腺癌中涉及的多种途径（包括细胞周期和DNA修复）

③、再接着做ppi网络，找到了一组高度互联的PRMT2下调基因的网络。这一组基因是动粒和DNA修复途径的核心成员。（动粒和DNA修复途径和癌症的是相关的通路）

④、接着再第二步做差异分析的时候，发现在PRMT2沉默的MCF-7细胞中。编码RORγ的mRNA表达显著增加，然后通过TLDA验证。

⑤、进一步评估RORγ表达对转移性乳腺癌患者临床预后的影响，得出结论是RORγ高表达的，病人会有更好的生存率。也就是说得出“PRMT2降低--RORγ升高---生存率升高”这样的关系

⑥、后面通过整个-PRMT2依赖性基因、PRMT2-up、PRMT2-down基因集去做生存分析，继续验证⑤里面的，PRMT2表达降低，可以提升病人生存率

⑦、后面再通过WGCNA识别出7个基因模块。重要的是红色模块7、这个模块和癌症的增值和转移的的泛癌基因有很多重合。也就说PRMT2和RORγ在这两个泛癌基因模块里面，是存在负相关的

⑧、最后作者通过紫外诱导MCF-7细胞，去证明PRMT2缺失增加了MCF-7乳腺癌细胞的DNA损伤修复。DNA损伤修复通路也是和癌症相关的。

3、存在的问题是：

①、湿实验的，很多不会，甚至没接触过。：①、养细胞 ②、siRNA转染细胞 ③、伤口愈合迁移试验 ④、紫外线损伤分析实验。

这部分的话，我现在的实验室是没有的。我得去问我宿友实验室那边看一下，他们那边有养细胞的，起码要熟悉流程。或者b站上相关的实验课程。

②、整个生信分析：

差异分析

通路分析

ppi网络

生存分析

HR analysis--？？？没接触过

WGCNA--？？听过，但是没做过

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