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美国洛克菲勒大学人类传染病基因遗传实验室Shenying Zhang团队，在Nature Medicine杂志上发表题为Human SNORA31 variations impair cortical neuron-intrinsic immunity to HSV-1 and underlie herpes simplex encephalitis 的研究论文，该研究发现SNORA31通过一种独特的机制控制中枢神经系统神经元对HSV-1的抗病毒固有免疫反应。
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）脑炎（HSE）是典型的散发性疾病。尽管少见，HSE却是西方国家甚至全球最常见的偶发性病毒性脑炎。在未得到及时治疗的情况下,HSE的死亡率达100%。目前临床上普遍采用阿昔洛韦治疗HSE，然而HSE幸存者都表现出严重的神经系统后遗症。该研究团队一直致力于病毒性感染疾病发病的遗传基础研究，前期发现了TLR3和DBR1介导的中枢神经系统细胞内源性免疫的先天性错误可分别导致前脑和脑干HSE【1，2】。尽管如此，大多数HSE患者的突变基因仍然未知。基于此，该研究团队提出以下假设：一些患者由于中枢神经系统内在免疫力的先天性缺陷而发展为HSE，但这些缺陷基因并不一定与TLR3-IFN-α/β通路有关。
如何发现SNORA31与HSE的相关性？
研究团队采用全外显子组测序技术分析205名彼此无血缘关系的HSE患者的基因，并将2756例无病毒感染性疾病的和1511例数据库的正常人基因作为比对，发现在HSE患者中的一些基因存在罕见的杂合突变，其中SNORA31的杂合突变在HSE群体中显著富集 (P=0.00029；OR：11.4；95%置信区间：3.5-32.9)。SNORA31杂合突变具有四种，其中n.36T>C(V1，P1来自摩洛哥，P2来自沙特阿拉伯)，n.75C>G(V2，P3来自美国)，n.96T>G(V3，P4来自法国)和n.111T>C(V4，P5来自葡萄牙)(图1.a)。然而有6个健康亲属也为SNORA31杂合突变(图1.b)，但4个呈血清HSV-1抗体阳性。随后研究团队采用GERP++方法分析发现SNORA31的保守程度为所有snoRNA中的Top 5% (图1.c)。SNORA31是核仁小RNA 的一种，前期研究推测SNORA31可能指导核小RNA和核糖体RNA中尿苷残基异构化为伪尿苷【4】。
图1
这四种SNORA31突变体的突变核苷酸均为高度保守的位点。突变体V1(P1，P2)所在位点为在14种脊椎动物中高度保守的核苷酸(78%保守)，而V2(P3) 所在位点为的核苷酸（100%保守）。V3(P4)和V4(P5)都位于snoRNA二级结构的茎内(图1d)，而V3(P4)和V4(P5)位于环中，前者突变所在位点的核苷酸(64%保守)，而后者在预测的功能结构域中改变严格保守的核苷酸(100%保守)。最后通过gnomAD计算这四种突变体和所有其他49种变体的SNORA31二级结构的最小自由能变化(图1e)。变异体V1和V2是最不稳定的十个变异体之一，而V3和V4被预测不会对RNA结构产生任何显著的影响。
SNORA31突变后对自身的影响：
为了开展SNORA31的后续实验研究，研究者构建了野生型和突变型SNORA31的表达载体。然而qPCR和RNA blot都发现V1和V2突变体的表达水平远远低于野生型(图2. a-c)。随后使用CRISPR-CAS9获得 SNORA31杂合和纯合缺失的人胚胎干细胞(HESC)系并分化TBR1阳性（TBR1是皮层神经细胞的标志）的CNS神经元群体。由于SNORA31位于TPT1的第5内含子，因此也对这TPT1的表达进行了分析。杂合缺失的神经元有50%低水平的SNORA31表达，而纯合缺失的细胞显示完全丧失表达(图2.d)。TPT1的mRNA和蛋白质水平在两种细胞系中都是正常的(图2.d)。作为对照的另一个H/ACA类snoRNA SNORA34在所有等基因系中的表达水平与亲本相当。SNORA31在V1和V2突变体患者来源的成纤维细胞中表达也受到抑制（图3.a）。
图2
SNORA31突变对其已有功能的影响：
考虑到SNORA31可能指导核小RNA和核糖体RNA中尿苷残基异构化为伪尿苷【3】，包括18S rRNA中的U218位点和28S rRNA中的U3713位点。随后对来源于亲本、SNORA31缺失杂合子和纯合子等品系的hESC 来源的CNS皮层神经元的rRNA进行了伪尿嘧啶图谱测序分析(Pseudo-Seq)，结果显示在SNORA31纯合缺失细胞中，U218位点的假尿嘧啶信号几乎消失（图2.e）。SNORA31的杂合缺失对rRNA假尿苷酸化无显著影响。出乎意料的是，28S rRNA的U3713位点没有受到影响。因此，SNORA31突变在HSE发病中起作用可能涉及或不涉及U218的伪尿苷化。
SNORA31突变的成纤维细胞抗病毒固有免疫响应水平如何：
研究团队检测患者来源的成纤维细胞对TLR3和IFN-α/β受体激动剂的免疫响应水平。在Poly(I：C)刺激下，来自P2-P5的SV40成纤维细胞能诱导产生正常水平的IL-29(IFN-λ1)和IL-6 (图3b)。P2-P5来源的成纤维细胞对HSV-1感染高度敏感，并且 HSV-1(Kos株)的复制水平与TLR3或STAT1缺陷患者细胞中的水平相似或更高 (图3C)。然而外源性干扰素IFN-β使SNORA31-和TLR3-而不是STAT1突变的神经元对HSV-1产生抗性(图3d)。进一步表明SNORA31突变是一种不同于TLR3和STAT1缺陷的HSE的新机制。然而SNORA31的杂合缺失似乎并不影响EBV-B细胞和IPSCs的抗HSV-1免疫功能，这表明并不是所有的人类细胞类型都需要完整的SNORA31表达和功能来控制HSV-1。
图3
除了HSV-1外，SNORA31突变细胞对其他病毒的感染也相当敏感，包括水痘带状疱疹病毒(VZV)、麻疹病毒(MeV)、脊髓灰质炎病毒(MAPV)、水疱性口炎病毒(VSV)和脑心肌炎病毒(EMCV)。除脊髓灰质炎病毒外，这些病毒在SNORA31突变患者来源的成纤维细胞中的复制水平高于健康人来源的细胞，在TLR3或STAT1缺陷细胞中也观察到了同样的现象（图4）。
图4
SNORA31突变的神经元对HSV-1感染的敏感性如何变化：
最后研究者还发现SNORA31突变的患者hPSC衍生的皮质神经元易受HSV-1的影响：患者的iPSC衍生的皮质神经元对HSV-1的敏感性显著增强（图5.a-c）以及CRISPR/Cas9引入的SNORA31缺失的hESC来源的皮质神经元对HSV-1感染的敏感性也增加(图5.d-e)。
图5
SNORA31突变的神经元对HSV-1感染和免疫刺激剂的免疫响应水平又如何变化：
转录组分析显示SNORA31突变的神经元对TLR3和IFN-α/β刺激的免疫响应正常(图6.a-c)，而对HSV-1感染引起的免疫响应受损(图6.d-e)。
图6
总而言之，Shen-Ying Zhang和Jean-Laurent Casanova等人的研究显示，人SNORA31基因变异削弱了大脑皮层神经元对单纯疱疹病毒1（HSV-1）的固有免疫力，并为单纯疱疹病毒性脑炎发生提供了基础。
Gate言Gate语
非常棒的一个研究，将非编码RNA推上临床重要的一篇重磅研究。然而，此篇研究并未涉及SNORA31调控抗病毒免疫的分子机理，因此关于SNORA31影响抗病毒固有免疫的分子机理仍是个谜。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41591-019-0672-3
参考文献
1. S. Y. Zhang et al., TLR3 deficiency in patients with herpes simplex encephalitis. Science 317, 1522-1527 (2007).
2. S.-Y. Zhang et al., Inborn Errors of RNA Lariat Metabolism in Humans with Brainstem Viral Infection. Cell 172, 952-965.e918 (2018).
3. A. Kiss, B. Jády, E. Bertrand, T. Kiss, Human box H/ACA pseudouridylation guide RNA machinery. Molecular and cellular biology 24, 5797-5807 (2004).