文献阅读-三个Myb类的转录因子参与花粉管接收的过程

    本次阅读的文献，13年发表在《current biology》上的《Three MYB Transcription Factors Control Pollen Tube Differentiation Required for Sperm Release》的文章，通讯作者是美国布朗大学的Mark A. Johnson教授，本文发现了三个作用于雄方的MYB类转录因子参与调控花粉管的接收过程，这篇文章值得一提的是，用到了很多荧光材料来解决生物学问题。此外，中国农业大学的叶德教授也随后在《plos genetic》上发表了《MYB97, MYB101 and MYB120 Function as Male Factors That Control Pollen Tube-Synergid Interaction in Arabidopsis thaliana Fertilization》的文章，也是类似工作，叶德老师还是很厉害的，都能关注到很棒的基因，例如前几天看到一篇博士论文做到的MRAIS,这个基因RNA-seq表达量不算很高，但是他们也关注到了，可惜也是别人先发表了。

    这篇文章是一个典型的反向遗传学的思路，由于我们知道体外生长的花粉管转录组与通过雌蕊组织生长的花粉管转录组会存在差异，因为花粉管会存在一个类似于精子获能的过程来获得花粉管导向的能力，于是乎他们就想找到在雄方特异的表达的转录因子。于是他们关注到了MYB120,通过演化树发现，还有两个亲缘关系很近的转录因子MYB97,MYB101也是在雄方特异表达。于是要我说做个三突看表型吧！

MYB演化树分析

    将文章的时候先观察了这三个转录因子的表达pattern。MYB101可以看到主要是定位在营养细胞和花粉管中，MYB97只能在穿过柱头后的营养细胞中表达，MYB120的也是在穿过柱头的营养细胞中表达，但是很弱。三个转录因子亚细胞定位的一致性很好。

三个转录因子表达pattern

     然后观察突变体的表型吧，于是拿到MYB97,MYB101,MYB120的T-DNA插入突变体，发现单突，双突都没有败育表型，三突有了。表型有了问题就好办了。拿到多突后验证冗余性最好的办法就是做互补，任意补一个发现表型恢复了。于是乎下面最重要的问题就是到底哪个方面出了问题：花粉发育？花粉萌发？花粉管导向？花粉管接收？配子融合？利用三突突变体一个个尝试这些过程。利用DAPI染色发现花粉发育没有问题。通过带有LAT52:GFP的三突材料进行体外或者半体外培养，发现花粉管的萌发和生长不存在问题。然后将LAT52：GFP的三突材料与MS1的材料做杂交，看花粉管导向胚珠的情况，发现很多情况下，花粉管并不爆炸，成卷曲状。

A正常爆炸 B花粉管不爆炸成卷曲状 C定量

    随后用HTR10:HTR10:mRFP标记三突精细胞的核，用ACT11:MSI1:GFP标记雌方的细胞核。两者杂交，发现精细胞不与雌配子融合，且出现多花粉管事件。这些数据说明了配子融合的过程并没有发生，且导向也不存在问题。

♂HTR10:HTR10:mRF*♀ACT11:MSI1:GFP

为进一步讨论突变体影响的过程。作者用雌方用ACT11:MSI1:GFP标记，雄方花粉管用 LAT52:dsRed标记杂交，发现突变体花粉管出现过度生长的表型，且出现两根花粉管同时进入的现象。

♀ACT11:MSI1*♂LAT52:dsRed

     至此表型分析就到位了。由于发现了这三个转录因子的作用于是他们就想找下游吧。于是通过微阵列实验找啊找，于是乎他们用突变体的花粉以及WT的花粉管分别受给MS1，8h后观察提取雌蕊看表达差异，发现有45基因在MYB3突中表达量下调，3个基因显著上调，这里面有CHX家族成员和pectin裂解酶，例如有报道CHX21/23就参与了花粉管的导向和接收过程而果胶是花粉管外壁组成成分。于是作者就选了11个表达量下降4倍以上的基因。观察他们的表达pattern，发现这些基因也是在穿过柱头的花粉管中表达量才开始增加。q-RT pcr的方法进一步证明了这11个基因表达量的下降。其中这些差异表达基因中有很多值得关注地方，例如存在酶，跨膜蛋白以及分泌小肽。于是作者就找了一个小肽THIONIN，观察了其作用。发现早期在花粉表达不高，但是在半体外的花粉管中存在胞质当中，暗示其可能作为myb转录因子的下游起作用。

q-RT pcr

THIONIN:GFP

    这篇文章是一片典型的反向遗传学的经典文章，思路清晰明了。数据做的也很扎实，就是在找下游的时候，能否通过chip和RNA-seq连用的话，找下游的基序，表达量变化差异大，且在花粉管穿过柱头后特异的表达，结合这三个条件，数据筛选放松一些，也许能够筛选到很多有意思的结果。

    此外，简单介绍一下叶德老师的工作。因为MYB类转录因子广泛参与了植物各个生物学过程，叶德老师是单纯MYB类转录因子对于生殖作用的影响出发，筛选出在花粉和花粉管表达量的Myb，发现MYB33, MYB65, MYB81, MYB97, MYB101, MYB104 和 MYB120，然后利用q-RT PCR确定了97,101,120仅仅在花粉和花粉管表达，其他组织表达很低，而其他表达很广谱，于是乎关注到了这个基因。于是先接个gus看表达pattern。发现表达蛮特异的。

pMYB：gus

    然后买了T-DNA插入的单突构建myb3突，发现存在败育，且单个基因做回补，没问题。正反交实验发现雄方问题。苯胺蓝染色发现花粉管在过度生长，同时没有释放精细胞确定表型。他们也筛选了MYB3突的下游，发现存在24个差异表达基因。选择了其中三个下调8倍的基因，但是没有具体说是啥，验证了这三个基因与三个myb之间是存在互作的。两篇文章出发点不同，但是思路基本差不多，所以有好的基因赶紧做吧。