年初，英国牛津大学的Hashem Koohy课题组和Alison Simmons课题组合作在Cell杂志上发表了一篇题为“Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution”的文章，在这项研究中，作者利用高通量单细胞转录组测序和空间转录组测序构建了一个大规模的人类肠道发育的单细胞时空图谱，绘制了跨时间、跨位置和跨细胞区室的形态发生图。
接下来小编带大家一起走进这篇文章
在单细胞分辨率下人类肠道发育的时空分析
Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution
发表杂志：Cell（IF：41.582）
发表时间：2021年2月
应用技术：10x Genomics单细胞测序、10x Genomics空间转录组测序等
研究背景
肠道是人体最大的屏障器官，与肠道菌群共生，协调营养需求和免疫。多种相互关联的细胞类型构成了成熟的肠道及其独特的形态，但它们发育的分子基础仍不清楚。本研究从不同发育时间点和组织位置的17个胚胎收集了77个肠道样本，利用10x Genomics单细胞转录组测序及空间转录组测技术绘制了单细胞转录组数据的空间分布图，展示了跨越时间、位置和细胞间隔的形态发生。另外，汇编了一个整合的在线资源，包括细胞多样性、细胞信号传导和转录调控网络，以突出祖细胞起源和位置命运决定。
主要结果
1. 在发育时间和空间上对101种肠细胞类型进行分类
聚类分析分为9个肠腔，并根据转录标注注释上皮、成纤维细胞、内皮（EC）、周细胞、神经（ENS）、肌层、间皮、肌成纤维细胞和免疫细胞，并发现具有明显的位置和发育时间进程差异。根据关键的marker基因，进行精细的细胞注释，共发现了101个细胞类型, 并绘制了所有101种细胞类型之间的相互作用图，确定了两两细胞群体之间假定的受体-配体（RL）相互作用。
2. 单细胞的空间位置
对组织进行空间转录组（ST）分析，分析确定了每张切片中的5-13个斑点簇，它们映射到离散位置，使用单细胞图谱作为参考，并确定每个斑点可能的单细胞转录组组成，从而在空间上定位所有单细胞亚群。鉴定了2,893个与深度相关的基因（<5％ FDR），反映了不同层次的活跃途径——肌肉/神经过程（收缩/轴突形成）向吸收管腔功能（微绒毛组织和消化系统过程）发展的深度富集点，与细胞类型特征的顺序富集相符。
3. 人肠上皮发育
子宫上皮隐窝的形成建立了维持粘膜屏障的终生回路。单细胞测序捕获了17,622个上皮细胞，这些上皮细胞通过marker基因分为吸收性、分泌性、未分化、以及干细胞等，本研究观察到近端（小肠[SI]）和远端（结肠）样本之间存在显著的位置差异，这些差异由高特异性基因表达，并通过轨迹分析和几个TF模块证实，表明在隐窝形成之前，特定位置的转录程序已经在发育中建立起来。
4. 表皮干细胞的发展起源
研究人员观察到近端和远端表皮干细胞随着时间的推移逐渐增加，这与表皮干细胞转录程序的早期位置差异形成对比，例如远端LEFTY1 和近端FOXD1 及其下游调控网络基因。在早期发育中（孕后期12周前，PCW），研究人员发现了近端上皮干样祖细胞群，该细胞群发展为早期肠上皮细胞。这些细胞表现出许多原始功能，包括在中胚层分化重要的VTN 基因高表达，与表皮干细胞相比LGR5 表达较少，并且ONECUT2 表达参与上皮发育。这些细胞在SI中特异表达TFGATA4 ， SI是一种小鼠早期内胚层调节因子，在12PCW后，其表达大部分丢失这些细胞高表达转铁蛋白（TF），证实了铁代谢在绒毛形成中的重要性。
5. 特殊的神经上皮通路是表皮干细胞发育的开始
分泌型谱系细胞在12 PCW时出现，在8-10 PCW时检测到很少的杯状细胞。然而，12 PCW后的杯状细胞和肠内分泌细胞逐渐增加，反映出持续的成熟。分泌细胞进一步细分为11个亚群，反映了不同的肠内分泌细胞亚型以及SI特异性Paneth细胞，杯状细胞和NEUROG3 + 祖细胞群。肠内分泌细胞多样性和相关网络在很大程度上与隐窝形成一起建立。
相比之下，BEST4/OTOP2 细胞在隐窝形成之前的最早时间点出现，转录水平已经不同，并且随着时间的推移频率没有变化，这表明它们的发育可能与正常的隐窝-绒毛回路无关。此外，分析结果预测BEST4/OTOP2 与神经元细胞之间有很强的相互作用（同样在发育早期建立）。
6. 肠道血管生成
转录标签通常对应于结构特征，在内皮细胞中可以清楚地看到这一点，将内皮细胞分为静脉、动脉和淋巴管类型，并通过血管大小进一步区分。在发育过程中，观察到了从小血管到大血管的过渡，反映了肠道血管生成。相对于内皮细胞，周细胞亚型由血管生成驱动因子（PRRX1、THBS4 和ANGPT2）定义。进一步研究表明在较早时间点的大多数细胞都是高度循环的祖细胞。
7. 肠神经系统和固有肌层
与7-8 PCW晚期发展出现的细胞类型相反，肠神经嵴来源的细胞沿胃肠道迁移，进入包含神经元和胶质细胞的粘膜下和肌间神经丛。本研究确定了不同的神经元和神经胶质祖细胞，并捕获了5个神经胶质细胞和7个神经元亚群。在成年肠道中，神经元丛被肌肉包围，祖细胞和分化的肠平滑肌细胞（iSMCs）分别由PLPP2 和ACTA2 等基因标记。本研究确定了11个与iSMC相关的簇，包括PDGFRA +间隙细胞和Cajal间隙细胞的早期种群。本研究确定了描述肌细胞的关键转录因子网络，肌细胞中的KLF7 ，间质细胞和OM细胞中的TWIST2 。FOXF2 在内肌中特别活跃，类似于在小鼠中的报道。
8. 发育中的肠固有层的间充质细胞
基于成人单细胞转录组测序中建立的命名法将成纤维细胞命名为成纤维细胞1-4 （S1-S4）亚型。根据时间、位置和周期的差异进一步将它们细分为16个类。与成人相比，S3-like细胞不仅在子宫内形成了一个主要的成纤维细胞群，而且表现出更大的异质性。轨迹分析表明，未成熟的S3样细胞分裂为S3或S1/2/4谱系，另外发现S3-like祖细胞在增殖室中高度富集，表明这些细胞可能在这一时期产生大量分化成纤维细胞。
在胎儿空间转录组切片中， 将一些S3特异性基因的表达定位于成年组织中与脉管结构相邻的spot上， 将胎儿细胞类型的标签转移到成人空间转录组切片上，结果显示S3 HAND1+和S3 EBF+细胞的成年对应物聚集在大血管周围，这突显了这些细胞在形成肠血管支持方面的可能作用。
9. 引导肠道发育形态发生梯度的无偏映射
了解肠道发育的一个基本问题是局部形态因子梯度及其拮抗剂如何形成肠绒毛形态发生。本研究创建了一个涉及8条途径的基因形态发生图，用以阐明这些分子在空间和时间上的作用。利用共表达分析确定了11种细胞类型特异性和13种空间共定位的形态发生模块。这些模块通常与空间转录组中的组织深度一致，空间模块3由来自内皮细胞、成纤维细胞和周细胞起源的形态发生子组成，并且在组织深处。
10. S2成纤维细胞具有特定位置并控制上皮形成
隐窝周围S2成纤维细胞或端粒细胞通过表达生长因子β（TGF-β）超家族配体和WNT通路来提供上皮支持。本研究在发育过程中发现了三个不同的S2亚群，这些S2特异性基因形成了一个主要的粘膜下成纤维细胞形态发生模块，该模块包含DLL1，BMP5 和NRG1 。连同受体相互作用一起，这突出了S2细胞及其在上皮形成中提供的丰富形态形成生态位的重要性。本研究证实S2标记F3在隐窝形成之前就已经存在，并且形成的突起随着绒毛的形成而逐渐增加。因此，在人肠道中，S2型纤维母细胞不仅是维持上皮隐窝位所必需的，而且可能在其形成中发挥积极作用。
11．人类肠道免疫力的发展
a. 淋巴组织形成过程中的免疫细胞异质性
本研究捕获了发育过程中的2,199个免疫细胞，包括6个谱系（巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、适应性和先天淋巴细胞）。免疫细胞在SI中比结肠更为普遍，总体而言在孕早期之前尤其罕见。在10 PCW之前，观察到了髓样细胞富集，而在12 PCW时，涌入了大量的幼稚CD4+和CD8+ T细胞、NK细胞，1型先天性淋巴样细胞（ILC），以及3型ILC。
b. S4成纤维细胞是淋巴结构形成和维持的关键
派尔集合淋巴结（Peyer's patch）形成的其他关键介质包括基质组织细胞，它们通过CCL19、CCL21和CXCL13促进淋巴组织诱导细胞组织回归。本研究发现它们特异性地定位于两个S4成纤维细胞亚群，并且表达随着发育而增加。S4细胞亚群中受体相互作用的绘制突出了与多种免疫细胞的交互作用，包括通过VCAM1-ITGB7 传递ILC3信号。这进一步支持了S4在淋巴组织形成中的作用。
为了在空间上证实这些相互作用，本研究对成人空间转录组切片进行研究，其中粘膜下淋巴滤泡是独特的结构。在这些滤泡内及周围表达了S4和免疫细胞的关键标记基因，因子分析证实了多种成人免疫细胞（B细胞、T细胞和髓系细胞）和S4细胞类型。本研究还发现空间转录组中关键受体对的显著共定位，表明S4细胞是成年结肠中与卵泡相邻的成纤维细胞，在胎儿肠道淋巴组织发育过程中以时间依赖性方式出现。综上所述，这表明派尔集合淋巴结中相同的隐窝周围成纤维细胞作为上皮隐窝生态位支持细胞、淋巴组织形成的协调者和基质-免疫交互的介质，从而揭示了它们迄今为止未被认识到的高度动态的作用。
12. 绘制先天性肠道疾病的细胞基础
为了揭示可能导致先天性肠道疾病的时间关键性转录缺陷，本研究通过将749个已知的疾病基因与本研究中的单细胞转录组数据整合在一起，进而将先天性疾病与可能通过高度细胞类型特异性缺陷表现出来的表型，以及导致肠道、腹侧、会阴、神经节、炎症或肿瘤病理疾病的表型联系起来。
研究结论
本研究将单细胞转录组测序和空间转录组测序进行联合，绘制了随时间变化的肠道形态发生。确定了101个细胞状态，包括上皮细胞和间充质祖细胞群以及与关键形态发生相关的重要阶段过程。描述了隐窝-绒毛轴形成的原理，神经、血管、间充质形态发生和肠道的免疫种群，鉴定了发育中的成纤维细胞和肌纤维细胞亚型的分化层次，并阐述了它们的不同功能。明确了佩尔斑和肠道相关淋巴组织的起源，并描述了位置特异性免疫程序。本研究使用这一资源来呈现了形态发生梯度的无偏分析，这一梯度能够指导细胞分化的连续波并定义与罕见发育性肠道疾病相关的细胞和位置，汇编了一个公开可用的在线资源，即胎儿肠道发育的时空分析资源（STAR-FINDer），以期促进后续的相关研究工作。
参考文献
Fawkner-Corbett D,Antanaviciute A, Parikh K, et al. Spatiotemporal analysis of human intestinaldevelopment at single-cell resolution.Cell, 2021, 184: 1–17.
刘静 | 文案