摘要
茶黄素（TFs）是由内源多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）催化的儿茶素在红茶加工过程中氧化生成的，需要对其进行控制，以获得合适的TFs/TRs比值，从而获得更好的品质。不管加工技术如何，不是所有茶树品种的叶子都适合制作高质量的红茶。TFs的形成机制和决定茶叶加工适宜性的主要因素尚不完全清楚。我们在这里整合了茶叶的转录组和代谢物图谱，以揭示在红茶加工过程中，茶叶中的酶或代谢物是如何变化的。这些信息使我们能够鉴定出与茶叶加工中TF的生产有关的几个PPO和POD基因。我们鉴定了一个POD基因，其重组酶具有TF产物活性。POD催化合成TF的能力可作为选育优质红茶品种的分子标记。
Introduction
红茶富含多酚，在膳食补充剂和功能性食品中获得了广泛的成分。据报道，红茶还具有多种生物特性，这些特性与抗氧化、抗癌和抗炎活性有关。1957年Roberts等人发现了茶黄素（TFs），属于另一类多酚色素，包括复杂的化合物，如TF1、茶黄素-3-没食子酸酯（tfa）、茶黄素-3′-没食子酸酯（tfb）和茶黄素-3,3′-二甘酸酯（TF3），这些物质均发现于红茶和乌龙茶中。TFs主要来源于儿茶素的氧化，可以进一步氧化和聚合成低聚物和聚合物，称为茶红素（TRs）。TF1及其没食子酸酯有助于红茶特有的色素和风味，以及它们对健康的巨大益处。除了TF和TRs，红茶还含有大量氧化产物和其他不明成分的混合物。尽管在感官评价和健康功能标准方面，高质量的红茶需要较高的TFs/TRs比值，但由于对茶树叶片材料中内源POD/PPOs和儿茶素的了解有限，往往难以对其提供过程进行适当的控制。传统的红茶工艺通常是根据个人经验进行的随机试验，其生产的产品在不同的质量标准上有很大的差异。这些都不能使得茶叶加工自动化和产品标准化成为可能。
在红茶加工中，内源POD/PPOs被用于生产红色素，其化学结构后来被确定并命名为TFs、TRs等。迄今为止，只有四种TFs是通过绿茶儿茶素与C.sinensis茶叶中的CsPPO/POD结合而获得的。酶法氧化表焙儿茶素和表儿茶素的混合物最初会产生TFs，而长时间的反应会减少产物。萘醌是TF的已知氧化产物，通过较长的发酵时间转化为TRs，TFs的酶或非酶降解或转化可能有助于TRs的产生。尽管已经确定了几种可能的TRs结构，但仍有许多复杂的成分有待确定。红茶通常是用适合制造优质红茶的茶树品种的叶子生产的。红茶原料的选择机制尚不清楚，且以经验主义为基础，红茶原料的选择导致了不同批次产品之间的差异。
虽然POD/PPO催化儿茶素氧化聚合形成TFs已有十多年的历史，但迄今为止，对茶树中CsPOD/PPOs的酶法鉴定还不十分清楚，对参与TF形成的CsPOD/PPOs的基因识别尚不清楚。这严重阻碍了红茶加工的自动化和红茶产品的标准化，因为不能正确控制红茶发酵过程。为了了解儿茶素氧化产生TFs和TRs的酶和分子基础，本研究系统地分析了茶叶基因组中CsPOD/PPO基因家族和CsPOD/PPO催化的tf形成。通过分析红茶加工过程中CsPOD的转录变化，并用重组CsPODs催化儿茶素氧化为TFs，我们能够鉴定出几种具有明显TF形成功能的CsPOD/PPOs，并经生化和遗传学研究证实CsPOD/PPO是茶加工适宜性的决定因素。这些知识对于理解和确定红茶加工的适宜性、红茶加工的自动化以及各种茶产品的标准化至关重要。
材料和方法
植物材料
从安徽农业大学实验茶园销售的茶树（纬度31.86°N；经度117.27°E；海拔20m）中采集不同茶树品种的样品。加工红茶由新鲜的样品（即新采摘的茶叶）、枯萎的样品（即最初被干燥以分解茶叶以释放果汁的茶叶）、卷曲的样品（即形成所需形状的茶叶）、发酵的样品（即卷曲后在23至29℃下发酵的堆积物）组成，和烘干样品（通过平底锅烧制茶叶来完成）。处理过的叶子在规定的时间取样。收集的样品在进一步使用前在液氮中被立即冷冻并储存在-80°C下，来自不同品种的新鲜叶片被立即培养用于发酵。
酶法测定及体外TFs合成
以牛血清白蛋白为标准，采用布拉德福德法测定每个收集管的蛋白质水平。如前所述，根据愈创木酚法测定总POD活性。用提取缓冲液（50 mM Tris HCl pH 7.0，1 mM DTT，20%甘油，1 mM PVPP，1 mM EDTA，5mmGCl2），4°C，12000转/分离心15分钟，用液体上清液进行活性测定。将10μL的酶提取物添加到1.5ml含有50 mmTris HCl（pH7.0）、10 mM愈创木酚和5mmH2O2的反应混合物中，然后每隔30s在470nm处测量吸光度的增加。POD活性定义为每毫克蛋白质每分钟OD470的变化。此外，用0.2%1-2-苯二醇、50 mM Tris-HCl（pH 7.0）和10μLofenzyme提取物在460nm处每隔30s测定PPO活性。
在体外，以10 mM儿茶素（EC、EGC、EGCG的混合物）为底物，1μL 30%过氧化氢和30μg POD蛋白在pH 8.0的磷酸钠-柠檬酸缓冲液中进行TF合成。建立了以等量缓冲液代替POD蛋白的控制系统。室温下10min后加入甲醇停止反应。
原位发酵实验
采用三氯甲烷蒸气提高叶片亚细胞膜透性的方法，对30个不同品种的甜瓜叶片进行了POD/PPO催化发酵（儿茶素氧化）试验。图像显示第三片茶叶的原位发酵。
HPLC法测定儿茶素和TF的含量
分析方法基于先前的流程进行。将0.03 g茶叶样品在70℃的1 mL 80%甲醇中在恒温水浴中冲泡10 min。上清液（10μL）注入安捷伦1260系列HPLCsystem（安捷伦技术），该系统配有安捷伦Aq C18反相柱（250m m×4.6 mm内径，5μm），并用安全防护盒（Phenomenex C18，4 mm×2.0 mm内径）保护。洗脱分为两个阶段：A（甲醇）和B（0.2%甲酸/水）。线性梯度程序如下：0-5 min，5%-20%A；5-18 min，20%-25%A；18-25 min，25%-42%；25-32 min，42%A。流速为1.0 mL/min。在两次高效液相色谱操作之间使用15 min重新平衡时间。检测波长设为278nm。柱温为30°C。参考标准EC、EGC、EGCG、TF1、TFAB和TF3购自Sigma Aldrich（德国斯坦海姆）。
TF采用waters e2695-HPLC，a2489紫外检测器和Phenomenex-Gemini（5μm，C18，250 mm×4.6 mm）柱测定。流动相含有A（100%甲醇）和B（0.2%乙酸），流速为1 mL/min。使用的洗脱过程如下：0-2 min，5%A；2-14 min，5%-20%A；14-20 min，20%-25%A；20-22 min，25%-42%A；22-28 min，42%A；28-31 min，42%-100%A；31-35 min，100%A；35-38 min，100%–5%A。检测波长设置为369nm。
LC/ESI-MS代谢物分析
采用LC/ESI-MS对TF1、TF2AB和Tf3进行了鉴定，并根据先前描述的方法对其进行了改进。36A Thermo Finnigan光谱系统由Accela高速泵、Accela制冷自动取样器和LTQ Velos离子阱质量检测器（ThermoElectron，San Jose，CA）组成，该检测器具有热电喷雾电离（H-ESI）界面合并使用。采用Hypersil金柱（2.1m m×150mm，粒径1.9μm，热科学），流速0.2ml/min。以含1%（v/v）ACN和0.1%（v/v）乙酸的水（洗脱液A）和含0.1%（v/v）醋酸的ACN（洗脱液B）作为洗脱液。使用以下洗脱曲线：0-1分钟，5%（v/v）B上的等比例；1-12分钟，5%到50%（v/v）B上的线性梯度；12-13分钟，50%到100%的线性梯度；13-18分钟，100%（v/v）B上的等比例；18-18.1分钟，100%到5%（v/v）B上的线性梯度；18.1-22分钟，5%（v/v）B上的等比例。设置负离子极性模式对于H-ESI源，H-ESI接口的电压保持在大约4kV。氮气同时用作鞘层气体和辅助气体，数据采集范围为250-2000。大多数设置都是通过使用Xcalibur2.07（Thermo Scientific）的“Tune Plus”自动调整进行优化的。传输管温度为350℃，电源电压为4.0kv。数据采集和处理采用Xcalibur2.1.0（Thermo Electron，加州圣何塞）。
RNA分离、cDNA文库构建
幼枝梢（顶芽和第一片叶）从C. sinensiscv舒茶早植物中收集，按传统红茶加工制作步骤：萎蔫、滚压、发酵。从每一步的茶叶中提取代谢物，提取RNA进行RNA序列分析。按照制造商的指示，用RNA试剂盒（北京生物技术公司）从这些茶叶中提取总RNA。从这些重复样品中提取0.5-2μg RNA，构建dna文库，然后由BGI深圳生物技术公司在IlluminaHiSeq2500平台上按照上述常规程序进行测序。根据茶树基因组序列获得每个生物样品的总清洁数据约7gb，作为基因组装和注释分析的初始rna序列数据。使用express计算每千碱基perMillion mapped Reads（RPKM）的读取数和读取计数。下面的DGE数据分析与公布的方法类似。数据利用数据量化了茶树基因的RPKM值
qRT-PCR
用生物技术公司（北京）提供的RNA分离试剂盒从不同的加工茶叶中分离总RNA。简言之，10μg总RNA经无RNase的dnasei（Promega，Madison，WI）处理以去除任何样本中的任何基因组dna污染。用Prime-ScriptH-RT试剂盒（Takara，lialian，Code，DRR037A）合成了qRT-PCR的互补DNA（cDNA），每个cDNA样品在无菌和蒸馏的waterfor-qRT-PCR反应中稀释10倍。管家基因CsACTIN（TEA019484.1）的相对表达值显著增加，研究中使用的所有引物序列均列于表S1中。
异源表达、大肠杆菌重组蛋白纯化
CsPODs的全长ORF用基因特异性引物进行端到端PCR获得。并亚克隆到表达载体PET-28A中。将重组PET-28A-CsPODs转化为E. coli Novablue（DE3）竞争细胞（Novagen，Schwalbach，德国）。表达菌株在37℃下生长在含有50μgmL-1卡那霉素的200 mL Luria-Bertani培养基中。后来，当OD600达到0.4到0.6之间时，在介质中加入0.1mm的IPTG。培养物在16℃下孵育16h。在4℃下通过离心和超声波处理获得细胞。重组蛋白用5毫升HiTrap螯合柱（GEHealthcare，乌普萨拉，瑞典）与缓冲液a（20毫升Tris HCl，pH 7.5，150毫米NaCl，10%（v/v）甘油和20毫米咪唑）预平衡纯化。在缓冲液A中使用增加浓度（从50到500 mM）的咪唑逐步洗脱蛋白质，在每个浓度下传递2个柱体积的缓冲液。咪唑在HiTrap脱盐柱（GEHealthcare，乌普萨拉，瑞典）中使用20 mM Tris-HCl缓冲液在pH值为7.5（含150 mM NaCl和5%（v/v）甘油）的条件下去除。纯化后的重组蛋白用于体外活性测定。
茶树茎尖PODs的反义敲除
利用寡核苷酸（ODN）反义抑制茶树茎尖的外源基因，研究内源POD基因敲除对红茶发酵的影响。基于克隆序列设计了反义ODN（asODN）抑制实验。用Soligo软件（http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/Soligo.pl）对候选ODN序列进行检测，以预测合适靶区的反义效率。表S1中提供了底漆。渗透实验如前所述。47，48个ODN溶于80 mMsucrose中，最终浓度为700μM。花芽经过3天的孵育后，用手加工制成红茶。样品在进一步分析前收集并储存在-80°C下。
统计分析
所有实验均独立进行，一式三份。采用sttest进行统计分析，p值小于0.05被认为具有统计学意义。
结果
红茶加工对酚类代谢的影响
红茶加工过程中酚类物质含量和POD、PPO酶活性变化较大，对红茶加工过程中产生的代谢产物含量也进行了分析。结果表明，与红茶加工用鲜叶相比，发酵过程中儿茶素含量显著降低74%，总儿茶素含量增加，TF含量增加约2.3倍（图1a、b）。儿茶素主要通过苯丙酸和类黄酮途径合成（图1c）。在苯丙酸途径中，苯丙氨酸可以通过pal、C4H、4CL、CHS和chigenes转化为柚皮素。5、4、4、8和6个转录本分别被注释为asPAL、C4H、4CL、CHS和chi。其中，pal、TEA014864ofC4H、TEA027829of4CL、三个转录本（TEA023333、TEA023340和tea034042）ofCHS和tea034003在鲜叶中的表达均高于其它相似亚型（图1d）。所有这些基因在红茶加工过程中都明显下调，除了C4H（TEA014864）在供应阶段先下降后上升外，例如，PAL（TEA024587）和4cl（TEA027829）、CHS（TEA034042）和chi（TEA034003）的转录分别下降了60%、68%和68%，分别（图1d）。在9个关键基因中，除了在红茶加工过程中上调的f3′5′H（TEA013315）外，所有基因的转录水平都显著下降（图1d）。此外，F3H（TEA023790）的转录本减少了90%，f3′H（TEA006847）、FLS（TEA006643）、DFR（TEA032730）、ANS（TEA010322）、ANR（TEA022960）、LAR（TEA027582）和scpl（TEA034055）的转录本减少了90%、53%、79%、29%、71%、76%和33%（图1d）。LAR-SCPLandANS和R-SCPLare与儿茶素含量有着千丝万缕的联系，所有这些基因在红茶加工过程中都受到下调，这与红茶加工后儿茶素含量降低的结果一致（图1）。此外，单宁水解酶是一种酶，它水解可水解单宁的酯键，如asEGCG，产生没食子酸和EGC。在茶叶基因组中发现了一些单宁水解酶样基因，与新鲜叶片相比，主要单宁水解酶（TEA029516）在枯萎和卷曲过程中上调了约2倍（图S1）。我们的研究结果与先前的研究结果一致，但是，需要进一步研究基因之间的相互影响如何调节茶树儿茶素的合成。
红茶加工不同阶段的POD/PPOs转录谱分析
尽管人们知道POD和PPO参与了红茶的加工过程，但它们的表达模式直到现在仍然是看不见的。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和转录组分析了红茶加工不同阶段pod和PPO的转录谱，结果证实大部分pod和PPO在红茶加工不同阶段均有表达，转录组与qRT-PCR数据相当（图2）。发酵期SAPx6的表达量比鲜茶期高3倍，红茶加工期SAPx1、CsPOD18、CsGPX1和CSGPx4的表达量较高，进一步说明这些基因可能是主要基因（图2和图S2、S3）。高丰度基因CsPOD7、CsPOD11、CsGPX2和csgpx3显示出红茶显著的加工后下降，其中scspod3、CsPOD5、CsSPX1、CsSPX2、CsSPX10、CsSPX11和csgpx5displayedupregrated表达式（图2）。所有剩余的CSGPX基因在红茶加工过程中都表现出低表达（图2和图S2和S3）。另外，CsSPX4、CsPOD2、CsPOD6和cspod19在红茶加工的萎蔫期和滚压期均能下调，在红茶加工的发酵期上调。具体来说，四个基因，CsPOD1、CsPOD7、CsPOD9和CSPOD19，在鲜叶中都有较强的表达，但在红茶加工过程中表现出被下调的趋势，其余的PODs表现出较低的表达水平（图2）。在红茶加工过程中的三个PPO基因中仅检测到YCSPPO2（图S3）。相比之下，在红茶加工过程中，主要的基因如SSPX1、CsSPX2、CsSPX10和CSSPX11被激活（图2和图S3）。
CSAPx1克隆、酶纯化、pH、温度优化
由于我们不知道哪一个POD或PPOs可以利用儿茶素类底物合成TFs，我们克隆了三个POD，它们的表达水平相对较高，分布在不同的分支之间。用镍树脂纯化了CsGPX1、CsPOD19和CsAPX1在其标记的融合蛋白中的表达，它们的大小和预期的一样（图3a）。三个PODs都表现出能够改变10毫米愈创木酚颜色的酶活性（图3b）。pH值至关重要，因为它可以改变底物和酶分子的电荷状态，进而影响酶和底物的结合。SAPX1和CSPOD19的最佳pH值为8.0（图3c），而SGPX1的最佳pH值为6.0。酶活性的最适温度也受分析所用底物的影响。似乎温度对CsGPX1和CsPOD19的活性没有影响。所有PODs的最佳温度在30到80°C之间；然而，CSAPx1显示出极高的最佳温度（80°C）（图3d）。
CsPOD/PPO催化合成TFs
我们探索了以儿茶素为原料，用氯代脚合成全氟辛烷磺酸的可能性。在磷酸钠-柠檬酸缓冲液中，将儿茶素（10 mM；EC、EGC和EGCG的混合物，比例为1:1:1）和等量的纯化CsPOD混合，结果表明CsAPX1（TEA109211）可以改变儿茶素的颜色（图4a）。高效液相色谱（HPLC）分析显示，63%的儿茶素被CsAPX1转化（图4c，图4）。进一步分析还表明，产生了TFs和TF中间体，并与对照组进行了比较；CsAPX1产生了12倍的量（图4b，d）。与此一致，检测到大量TF中间体，CsAPX1产生的量是对照组的4倍（图4b，d）。TFs是一组聚酚类色素，包括TF1、tfa、tfb和TF3，存在于红茶和乌龙茶中。MALDI-TOF-ms分析发现anm/zratio为563.2162，与TF1相同。此外，在质谱中还发现了tf和TF3，并且分别在tf和TF3中发现了715.1476和867.3331的m/zratios（图4e）。
抑制SAPx1的表达降低TF的形成
为了证实CAPX1在合成TFS中的作用，我们研究了这些PODs在植物芽和叶中的敲除是否会影响TF的形成。由于目前还没有成功的茶树转基因技术，我们试图用CSAPX1反义寡核苷酸（asODN）转染未转化对照的芽（图5a）。与转染剂对照组比较，寡核苷酸转移（sODN）对照CSAPx1在qRT-PCRanalysis的基础上显著降低了Sapx1的转录水平，并且不影响SGpx3的表达（图5b，图S5），导致刺激发酵后TF1含量显著降低（图5c，d）。在转化和模拟发酵后的三天，asODN转化的芽仅含有对照组的大约三分之二的TF1（图5c，d）。此外，观察显示抑制sapx1降低了TF2的产生（图5d）。儿茶素分析显示，与对照组相比，只有EC和EGC显著降低；特别是，在CsAPX1的抑制系中检测到20%的EC降低（图5e）。结果表明，在红茶发酵过程中，CsAPX1对tf的合成及不同酚类化合物的配比起着关键作用。
茶叶加工适宜性的测定
根据加工的适宜性，可以选择新鲜茶叶加工成不同的优质茶叶，如依次经过搅拌、滚压、干燥工序的绿茶；经过通风、干燥工序的白茶；经过萎蔫、摇晃、瘀伤、固定、滚压、干燥工序的乌龙茶一步一步地枯干、滚动、后发酵和干燥。由于CsPOD/PPO对红茶加工过程中TFs含量的影响，CsPOD/PPO在适合不同茶叶品种的叶片中的表达情况如何？现场发酵试验表明，所收集的茶叶种质中存在显著的发酵变异性，这些种质已被筛选用于制作不同的茶叶（图6a）。同时，大多数CsPOD/PPO基因在JF、NKZ和CSA等品种中获得相似的转录产物，这些基因对绿茶和红茶都适用（图6b）。同样的情况也反映在FYL、RX、ZJ、BJG和CTA品种中，这些品种适合绿茶、白茶、乌龙茶、黑茶和红茶（图6b）。尽管存在上述情况，但许多CsPOD/PPO基因在发酵茶（红茶和黑茶）和非发酵茶（绿茶）之间表现出明显的差异，如：ASCPOD1、CsPOD14、CsAPX1、CsAPX2、CsAPX3、CsAPX4、CsGPX1、CsGPX2、CsGPX4、CsSPX1和CSSPX2等（图6b）。更有意思的是，CsAPX3、CsAPX4、CsGPX2-4和cspod14更可能在那些适合制作发酵茶的品种中被表达。CsPOD1、CsPOD2、CsPOD4、CsPOD5、CsPOD7、CsPOD8、CsPOD13和csspx2很可能在那些不适合制作未发酵茶或部分发酵茶的品种中表达（图6b）。其余的CsPOD/PPO的表达似乎在不同的品种中没有差异，这些品种被选择形成不同的茶（图S6a）。不同品种的差异表达基因需要进一步研究。此外，相关系数分析发现，POD、累积Csspx、CsGPX的累积表达与多酚含量的相关性稍强；NCSPOD/PPO的TPM与多酚含量的其他相关系数也很低，如APX的总TPM和儿茶素含量（图6c、图S6b）。同时，多酚和儿茶素含量与POD/APX/GPX/SPX表达呈相反关系（图6，图S6）。
Discussion
POD和PPO在C. sinensis中起着多种作用，这些作用包括抵御病原菌、低温伤害、机械损伤、黄酮类化合物氧化为TFs和茶叶发酵过程中的试验，转录组和代谢谱分析发现，红茶加工过程中，儿茶素的分解代谢和茶黄素的生成以及参与这些过程的基因表达均发生了剧烈的变化。此外，128个CsPOD和PPO基因在红茶不同品种和不同加工阶段的表达也不同。系统发育树中每个亚群的三个新的CsPOD基因是从C. sinensis的叶片中获得的。只有CsAPX1能在体外利用儿茶素进行合成，其抑制素TFs的含量，改变不同酚类化合物的比例。本研究结果为进一步研究CsPOD和PPO在红茶加工中的生物学作用提供了依据。
红茶加工对儿茶素代谢的影响
茶多酚类物质，如儿茶素和茶黄素，是红茶中的主要成分，在红茶加工过程中发生了巨大的变化。儿茶素作为多酚的组成成分，通过莽草酸途径、苯丙酸途径、黄酮途径等次生代谢途径合成，与茶叶的口感和品质密切相关，具有苦涩的口感，与茶氨酸、咖啡因一起，是茶多酚的重要组成部分，构成茶叶的主要生物活性和保健功能成分。在本研究中，所有儿茶素的含量都严重下降，发酵阶段总儿茶素的含量比鲜叶中的含量增加了74%，这与之前的研究是一致的。然而，由于最近发表的茶基因组，在红茶加工过程中，许多基因都表达了，而且它们的表达趋势也与茶多酚产品一致（图1）。研究结果为红茶加工过程中同时发生的生物和化学反应以及影响红茶品质的多种儿茶素调控基因的加工提供了新的认识。
CsPOD/PPOs参与红茶加工
有证据表明CsPOD和PPO基因在TF合成中起着关键作用。在128个成员中，大部分成员的转录水平在红茶加工过程中被显著诱导或抑制，包括水分损失、机械损伤和热应激（图2，图S3）。代谢产物分析显示发酵期红茶中儿茶素含量急剧下降，这与CsPOD和ppo活性以及某些CsPODs如spod3和cspod5的表达一致（图2，图S3）。以前也报道过红茶加工过程中POD活性的类似结果。我们目前的结果表明，红茶加工过程中诱导了CSPOD18和CSPOD3的表达（图2），表明两者都可能促进合成C.sinensis中TFs。相比之下，红茶加工抑制了CSPOD19和CSPOD20的表达（图2）。这一结果可以解释茶叶中CsPOD和PPO基因家族的功能倍增性。
CsAPX1可合成TFs
虽然化学合成法可以制备大量用于生物分析的纯TFs，但由于TFs的丰度低，纯化过程具有挑战性，以往对TFs的研究主要集中在混合物的制备上，从马铃薯中提取TFs酶，将茶儿茶素转化为TFs，用49科62株植物的匀浆处理，得到类似的表儿茶素和表儿茶素产品，其中46株植物能合成TF，无论是否含有儿茶素，茶色素（主要是TR和茶黄素）也可以通过真菌漆酶催化的EGCG氧化得到。进一步，对红茶色素TF在茶儿茶素酶氧化过程中的反应进行了深入研究，结果表明TF与表儿茶素醌偶联生成的产物具有多种结构，我们的研究小组注意到，在儿茶素中添加CsAPX1可显著促进TFs的产生，抑制CsAPX1可显著降低TF1的产生，并改变不同TFs的比率（图4和图5）。鉴于先前的研究结果和我们目前的研究结果，我们确信CsAPx1基因在红茶加工过程中使用儿茶素产生TF的过程中起着关键作用。更有趣的是，对CsAPX1的破坏也降低了tf的水平。总之，我们发现了一个POD基因CsAPX1，它参与了TFs的合成并影响了TF家族的含量，这一发现对红茶产品的标准化具有潜在的帮助。
CsPOD/PPO是茶叶加工适宜性的重要决定因素
我们的结果显示CsPOD/PPO的表达与茶叶加工的适宜性相关，但不强（图6，图S4）。事实上，儿茶素、咖啡因、氨基酸（主要是茶氨酸）、水提取物（包括无机元素、碳水化合物、脂类等）和加工类型都会影响茶叶的品质。也有报道称，总酚与总氨基酸的比值是选择种质的重要鉴别指标。另外，总酚与总氨基酸的比值是筛选种质的一个重要判别指标。此外，（EGCG-ECG）×100/EGC的比值较高，表明绿茶品质较高，多酚含量与POD/APX/GPX/SPX表达呈相反关系，有助于植物适应环境胁迫，减轻多酚含量过高对植物的伤害，POD/APX/GPX/SPX的释放导致植物对响应物质的过量抗性和积累。这意味着Cspod/PPO是重要的，可以决定茶加工的适宜性。此外，我国茶树种质资源丰富多样，对茶树种质资源的鉴定和评价对茶树品种开发和茶叶加工适宜性的生物技术工作具有重要意义。CsPOD/PPO和TFs的研究为茶叶品质提供了一个前瞻性的依据。
综上所述，黑茶加工过程中儿茶素的代谢和参与黑茶加工的全局基因表达发生了巨大变化。此外，对红茶加工过程中POD基因的详细分析，使我们能够确定生产茶黄素所必需的CsAPX1过氧化物酶。CsAPX1在体外合成茶黄素，抑制茶叶中的sapx1影响茶黄素的产生。最后，不同茶树品种叶片中POD的表达差异显著，可能决定了茶叶加工的适宜性。本研究增加了对茶中CsPOD和PPO基因的了解，有利于红茶生产标准化，为进一步阐明CSPOD和PPO基因的生物学功能奠定了基础。然而，在未来的研究中，每个基因的确切功能需要进一步阐明。此外，不同品种的差异表达基因可作为作物改良计划的潜在候选基因和影响茶叶加工适宜性的重要因素。
Reference
Transcriptome and Metabolic Profiling Unveiled Roles ofPeroxidases in Theaflavin Production in Black Tea Processing andDetermination of Tea Processing Suitability 2020 J. Agric. Food Chem