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题目：Metabolic regulation by PD-1 signaling promotes long-lived quiescent CD8 T cell memory in mice
期刊：Science Translational Medicine
日期：13 October, 2021
链接：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.aba6006
摘要
在慢性病毒感染和癌症中，功能失调的CD8 T 细胞可以通过程序性细胞死亡受体1 (PD‑1) 轴发挥抑制性作用。尽管PD‑1在急性感染和免疫接种过程中也会被短暂地诱导至较高水平，但其对长寿命抗原非依赖性记忆T细胞发育的影响仍不清楚。除了其抑制克隆效应扩增的预期作用外，在本研究中，我们证明了PD‑1在抗原特异性CD8 T细胞上的表达对于抗原清除后形成持久的记忆CD8 T细胞库是必需的。T细胞特异性PD‑1信号的丢失导致记忆CD8 T细胞响应稳态细胞因子信号收缩的增加和抗原非依赖性更新缺陷，从而导致记忆CD8 T细胞库随着时间的推移而损耗。尽管在慢性病毒感染期间，耗竭的CD8 T 细胞在PD‑1检查点阻断后重新恢复功能，但响应先前经受免疫原产生应答的静息态功能性旁观者记忆CD8 T细胞库则减少了。在代谢方面，PD‑1信号轴对于调节mTOR依赖的合成代谢糖酵解和脂肪酸氧化程序的平衡是必要的，以满足静息态记忆CD8 T 细胞的生物能量需求。这些结果表明，PD‑1是保护性T细胞免疫应答的关键代谢调节剂。此外，这些结果对PD‑1检查点阻断治疗期间预先存在的记忆CD8 T 细胞具有潜在的临床意义。
5. PD-1信号调节稳态维持中的记忆CD8 T细胞的代谢程序
记忆CD8 T细胞的稳态维持与其代谢状态密切相关。CD8 T细胞从细胞毒性效应T细胞向静息态记忆T细胞的转变过程中，其糖酵解代谢途径减少而脂肪酸氧化途径增加 (73)。鉴于PD-1与T细胞激活期间糖酵解代谢的调节有关(41)，我们想探究在抗原非依赖性稳态期间，PD-1缺陷的记忆细胞死亡增加是否与代谢调节障碍有关，从而导致细胞的稳态增殖和存活能力受损。为了解决这一问题，我们在感染后第22天纯化了PD-1野生型和缺陷型的记忆CD8 T细胞(此时WT记忆CD8 T细胞通常表现出稳态增殖，且此时仍可获得足够数量的PD-1缺陷细胞)，并进行Seashore细胞外流量测定(图5A至D)和代谢组学评估(图5E)。结果发现，PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞表现出比WT细胞(图5A至D)更多的糖酵解和三羧酸(TCA)循环通量(通过细胞外酸化率ECAR进行测量)，以及氧化磷酸化强度(OXPHOS，通过耗氧率OCR进行测量)，并且在葡萄糖存在的条件下具有略微增加的备用呼吸能力(SRC) (图5A，图S5A)。类似于在TCR诱导激活期间PD-1介导的糖酵解通量抑制作用(41)，我们观察到一个有趣的现象，PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞中需氧糖酵解增加，因为记忆CD8 T细胞通常在缺乏同源抗原的情况下可以持续存在。因此，我们试图通过确定PD-1依赖性葡萄糖内流是否受到稳态信号的影响来扩展这些发现。与葡萄糖氧化增加相一致，缺乏PD-1的记忆CD8 T细胞在葡萄糖摄取方面比WT细胞更有效(图5B)。同时，我们还使用TCR刺激或共用γ-链信号分子刺激诱导了WT和PD-1缺陷型记忆T细胞中的葡萄糖摄取(图5B)，尽管PD-1缺陷型记忆T细胞保留了比WT记忆T细胞更高的葡萄糖摄取特性(图5B)。这些数据表明，PD-1在记忆T细胞发育或稳态维持中具有糖酵解调节作用。
尽管效应T细胞更加依赖于葡萄糖驱动的合成代谢来满足其生物能量需求，但初始和记忆CD8 T细胞则主要依赖于脂肪酸氧化代谢途径(74)。因此，我们接下来评估了PD-1信号对记忆CD8 T细胞中脂肪酸β-氧化的影响。在脂肪酸作为唯一能量底物存在的情况下，我们观察到WT和PD-1缺陷型记忆CD8 T细胞中的糖酵解通量最小(图5C)。然而，T细胞特异性PD-1信号的缺失会导致记忆CD8 T细胞的脂肪酸氧化功能受损，其OCR显著降低(P<0.001，图5C)。与由于糖酵解增强导致的脂肪酸氧化减少和可能的脂肪酸合成增加相一致，当直接离体评估时(图5D)，以及在用IL-2、IL-7、IL-15或同源抗原刺激后(图5D)，PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞具有较高的脂肪酸含量。这些观察结果表明，PD-1信号促进了分解代谢程序，从而驱动记忆CD8 T细胞对脂肪酸能量底物的利用。与Seashore数据一致，PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞显示出糖酵解中间体丙酮酸盐和乳酸盐的含量显著上调(P<0.05，图5E)。并且，PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞中线粒体脂肪酸氧化辅因子乙酰卡尼汀和肉碱的丰度也下降了(P<0.05，图5E)。此外，PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞中脂肪酸氧化减少也与氧化型谷胱甘肽浓度升高和还原型谷胱甘肽浓度降低有关(图5E)，因此可能使细胞更易受到氧化损伤。
为了探究记忆T细胞在记忆维持期间是否主动需要PD-1信号来调节其代谢途径，我们在完全分化的WT记忆CD8 T细胞中使用PD-1抗体进行了PD-1信号通路阻断(图5F)。与PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞(图5A)相似，稳态条件下PD-1信号的消除导致在葡萄糖能量底物存在时ECAR和OCR增加(图5G和H)。PD-1信号阻断后，记忆CD8 T细胞的代谢紊乱与细胞数量有限下降(图5B)、稳态增殖速率缓慢(50天(75天)的间期)有关。与PD-1缺陷细胞收缩增加相一致(图3C)，细胞收缩期间PD-1信号阻断也导致记忆CD8 T细胞数量减少(图5C)。相反，在细胞扩增期进行PD-1抗体阻断并未导致记忆T细胞的数量下降(图S5D)。这与我们深入分析的效应T细胞分化的结果相一致。
与存在或不存在PD-1信号的效应CD8 T细胞具有相似的表达程序相一致，WT和PD-1缺陷的效应CD8T细胞在CTL扩增峰值时表现出相似的线粒体质量和膜电位(图S5E)。然而，在抗原清除后，PD-1缺陷的T细胞在第22天时表现出线粒体电位和线粒体质量的降低(图S5E，P<0.05)。这些线粒体异常在感染后第22天表现明显，此时在总H-2Db:GP33特异性CD8 T细胞以及CD127Hi KLRG-1Lo记忆命运细胞中均表现出记忆稳态(P<0.05，图S5F)。总的来说，这些数据支持了这样的观点，即在T细胞启动和克隆扩增期间，记忆代谢特性很可能不是由PD-1信号编程的。尽管如此，我们的代谢评估确定了PD-1信号在抑制利用葡萄糖产生能量和促进脂肪酸合成，以支持记忆CD8 T细胞通过脂肪酸氧化进行长期稳态维持的关键作用。因此，在未来的研究中，使用PD-1条件性、阶段特异性敲除技术，将能够更精确地描述PD-1信号在记忆CD8 T细胞分化发育的不同早期阶段以及稳态维持后期阶段之间的相对贡献。
图5.PD-1信号驱动CD8 T细胞的代谢开关以维持静息态的记忆表型。
6. 通过雷帕霉素减弱糖酵解作用可以逆转PD-1缺失导致的记忆存活缺陷
PD-1缺陷型记忆CD8 T细胞中糖酵解和脂肪酸含量增加表明在记忆维持期间，PD-1在促进糖酵解向脂肪酸氧化转化过程中发挥一定的作用。接下来，我们试图研究这些代谢差异是否可能与记忆CD8 T细胞的存活在功能上相关，以及代谢变化是否是通过mTOR通路介导的。为了解决这个问题，我们使用雷帕霉素进行处理(图6A)，它是一种临床批准的抑制mTOR依赖性糖酵解的药物(76)。结果表明，在体内缺失PD-1的情况下，通过阻断过量mTOR信号可以抑制异常糖酵解过程，从而挽救记忆细胞缺陷。
为了特别关注记忆分化期，我们在急性LCMV感染后约6天开始使用雷帕霉素进行处理，此时病毒已经得到控制。如前所示(77)，雷帕霉素处理后，WT的CD8 T细胞会上调Bcl-2，从而有助于记忆细胞在淋巴器官中的存活(图6B至D，图S6A)(图6E，图S6B)。然而，PD-1缺陷的CD8 T细胞对雷帕霉素处理的反应更加强烈，且处理后的细胞数量明显更高，尤其是在淋巴器官中(脾，P < 0.00；骨髓，P <0.01，图6D，图S6A)。在雷帕霉素处理的短窗口期间(第6-33天)，脾和骨髓(但不是肺和肝脏)中的记忆CD8 T细胞数量明显增加，这与淋巴器官是记忆细胞稳态维持的主要生态位(与非淋巴部位相比)相一致。除了总体记忆细胞的数量增加外，我们发现雷帕霉素处理后CD62LHi (图6F)和CD127Hi(图6G)的记忆CD8 T细胞的频率也增加了，并且与PD-1的表达无关。然而，与雷帕霉素处理后的WT CD8 T细胞相比，PD-1缺陷的CD8 T细胞的CD127Hi记忆T细胞的差异倍数增加了。如前所示(77)，雷帕霉素处理还降低了WT细胞中终末分化KLRG-1Hi细胞的频率(图6H)。与WT细胞相比，雷帕霉素处理后，PD-1缺陷型记忆CD8 T细胞中显示为终末分化的KLRG-1Hi细胞的差异倍数显著降低了(P<0.01图6H)。尽管如此，通过多功能性(或共同产生多种细胞因子的能力)评估，我们发现记忆CD8 T细胞的功能在WT和PD-1缺陷的CD8 T细胞中基本相同，且不受雷帕霉素处理的影响(图S6C)。接下来，我们想探究通过雷帕霉素处理挽救的PD-1缺陷型记忆CD8 T细胞是否与糖酵解率的下降有关。Seahorse分析结果显示，在PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞中，雷帕霉素处理后ECAR显著降低，并且与WT细胞相似(P<0.05，图6I)。总之，记忆期间PD-1阻断后的代谢失调，以及雷帕霉素处理后可以挽救PD-1缺陷细胞中的代谢缺陷和记忆细胞数量，支持了PD-1通过对mTOR依赖性代谢途径的调节维持记忆CD8 T细胞的稳态(图S6D)。
图6.感染后的雷帕霉素处理挽救了PD-1信号缺失导致的记忆细胞损耗。
7. 慢性感染期间PD-1免疫检查点阻断疗法会导致预先存在的功能性记忆CD8 T细胞功能受损
PD-1免疫检查点阻断疗法通过使耗竭的病毒或肿瘤反应性CD8 T细胞恢复活力，在治疗慢性病毒感染和肿瘤方面取得了巨大的成功(78)。我们的数据显示，急性感染或免疫接种中产生的功能性记忆CD8 T细胞表达PD-1的水平高于初始T细胞，但仍低于常规的耗竭T细胞，且后者可通过PD-1通路阻断进行功能恢复。接下来，我们试图确定慢性感染期间PD-1检查点阻断是否可能对先前感染反应已形成的记忆CD8 T细胞产生副作用，并导致旁观者记忆T细胞的损耗。为了研究这一点，我们首先接种LM-OVA并产生卵清蛋白(OVA)抗原肽特异性的记忆CD8 T细胞(图7A)。在接种LM-OVA约60-75天后，我们在这些OVA记忆CD8 T细胞小鼠中随后感染慢性LCMV病毒。用抗PD-1或抗PD-L1抗体阻断治疗OVA记忆CD8 T细胞荷瘤小鼠，并评估旁观者OVA特异性记忆CD8 T细胞的数量和功能特性(图7A)。如预期所想，在PD-1检查点阻断免疫治疗之前，OVA特异性记忆CD8 T细胞表达中等水平的PD-1(图7B)。另一方面，由于受到慢性抗原刺激，对LCMV GP33或GP276抗原表位特异的CD8 T细胞主要是PD-1hi细胞（图7B)。PD-1或PD-L1检查点阻断导致功能性恢复的LCMV特异性T细胞扩增，并且与病毒载量的降低相关(7)(图S7A和B)。然而，与耗竭的LCMV特异性T细胞相反，在PD-1或PD-L1抗体处理后，静息态的OVA特异性记忆CD8 T细胞的数量在淋巴和非淋巴组织中均下降(图7C和D，图S7C)，但在很大程度上保留了它们的记忆表型和功能特性(图7C、图S7D和E)，表现为相似的CD127和KLRG-1的表达，以及抗原再刺激时相似的IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生(图S7D和E)。在没有T细胞特异性PD-1信号的情况下，总体CD8 T细胞记忆群体收缩增加，与此一致，广义抗体介导的PD-1阻断并未导致记忆T细胞亚群总体组成的任何实质性改变(图7C，图S7D)。总之，与我们在CD8 T细胞特异性PD-1缺陷时观察到的记忆T细胞损耗结果相一致，在慢性感染期间使用PD-1检查点阻断治疗会导致静息态旁观者记忆CD8 T细胞发生损耗，这些结果表明了PD-1信号在功能性CD8 T细胞免疫记忆的长期维持以及临床干预中具有重要的调节作用。
图7.慢性感染期间PD-1免疫检查点阻断会减少抗原特异性记忆CD8 T细胞的总数。
总结
本研究的主要目的是探讨PD-1信号在记忆CD8 T细胞发育中的内在作用。PD1和PD-L1抗体阻断会引起全身免疫紊乱，多项临床研究显示长期治疗会诱导自身免疫(79-81)。因此，我们在一部分抗原特异性CD8 T细胞中采用了特异性敲除PD-1的策略，用于比较相同感染宿主中WT和PD-1缺陷型CD8 T细胞的记忆分化。在本研究中，我们对T细胞特异性缺失PD-1信号的研究结果表明: (I)在T细胞启动的早期阶段，PD-1在很大程度上对于T细胞的活化、早期增殖和效应分化是可有可无的，(ii)在CTL扩增的后期阶段，PD-1调控了克隆扩增和效应分化的适度减弱，(iii) PD-1对于产生最佳数量的记忆CD8 T细胞至关重要。通过整合细胞表型、功能、代谢组学和转录组学数据，本研究进一步为T细胞特异性PD-1信号如何通过调节mTOR依赖性葡萄糖氧化和增强脂肪酸氧化促进长期记忆T细胞稳态维持提供了新的视角。此外，本研究还提出了PD-1免疫检查点阻断治疗可能会导致旁观者功能性记忆CD8 T细胞的损耗。